一、 ATAC-seq原理和基礎(chǔ)知識

1. ATAC-seq原理

真核生物的DNA并不是裸漏的，而是組蛋白和染色體/染色質(zhì)結(jié)合。DNA一圈一圈的纏繞在8個組蛋白上，形成核小體。一個個核小體構(gòu)成串珠式的結(jié)構(gòu)，然后進一步折疊、聚合，并在其他架構(gòu)蛋白的協(xié)助下，形成染色體。經(jīng)過一系列操作就將超長的DNA鏈，折疊成很小的結(jié)構(gòu)，塞進小小的細胞核內(nèi)。

基因的轉(zhuǎn)錄，需要將DNA的高級結(jié)構(gòu)打開，但是不需要DNA鏈全部解開，只需要打開一部分，也就是基因表達的區(qū)域解開即可。這一過程，主要由染色體組蛋白的修飾（尤其是乙酰化）來實現(xiàn)的。這部分打開的染色質(zhì)，就叫做開放染色質(zhì)（染色體和染色質(zhì)是同一種物質(zhì)的兩種形態(tài)，染色質(zhì)是伸展狀態(tài)，染色體是高度螺旋的狀態(tài)）。而染色質(zhì)一旦打開，就允許一些調(diào)控蛋白（比如轉(zhuǎn)錄因子）跑過來與之結(jié)合。而染色質(zhì)的這種特性，就叫做染色質(zhì)的可及性，所以說染色質(zhì)的可及性反應(yīng)的是調(diào)控因子與開放染色質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)，與轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)。
ATAC-seq是如何找開放染色質(zhì)區(qū)域的呢？
使用了轉(zhuǎn)座酶Tn5：DNA轉(zhuǎn)座是一種由DNA轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)，把DNA序列從染色體的一個區(qū)域插入到另一個區(qū)域的現(xiàn)象，類似”粘貼復(fù)制“。這個過程也是需要插入位點的染色質(zhì)是開放的。
既然轉(zhuǎn)座酶Tn5容易結(jié)合在開放染色質(zhì)上，只要人為的將NGS接頭連接到轉(zhuǎn)座酶，攜帶這些接頭的轉(zhuǎn)座酶進入細胞核后，切開染色質(zhì)開放區(qū)域，使染色質(zhì)斷裂并將這些接頭插入到開放的染色質(zhì)區(qū)域中，這樣裂解細胞、破碎DNA后，利用已知序列的測序標簽進行NGS測序，就知道哪些區(qū)域是開放區(qū)域了。

2. Tn5轉(zhuǎn)座子

1. 轉(zhuǎn)座概念

可移動的DNA片段即可移動因子在基因組上自由轉(zhuǎn)移稱為轉(zhuǎn)座，DNA與所插入的基因位點可以是非同源的。轉(zhuǎn)座是產(chǎn)生基因多樣性的重要機制，可移動因子可產(chǎn)生插入、缺失、倒置以及染色體融合突變。
轉(zhuǎn)座需要通過轉(zhuǎn)座酶來催化。原核生物的轉(zhuǎn)座分為兩種方式，復(fù)制轉(zhuǎn)座和保守轉(zhuǎn)座：

• 復(fù)制轉(zhuǎn)座的供體DNA完整，把通過復(fù)制的DNA片段插入基因位點上
• 保守轉(zhuǎn)座則是從供體DNA上分離一段DNA，以轉(zhuǎn)座酶為中介，連接到目標DNA上而實現(xiàn)的

2. 參與分子

• 轉(zhuǎn)座子（Transposon） ： 可移動DNA片段
• 轉(zhuǎn)座酶（Transposase / TNP）：催化轉(zhuǎn)座的蛋白質(zhì)；野生型Tn5轉(zhuǎn)座酶是一種活性極低的蛋白質(zhì)
• 目標DNA（Target DNA）： 可以與轉(zhuǎn)座子在同一個DNA分子上，甚至轉(zhuǎn)座子內(nèi)；或在另一個DNA分子上

1. 轉(zhuǎn)座子

（1） 簡化的轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)

包含合成Tnp的DNA序列，兩個19bp長的末端以及任意DNA序列。

• 末端是兩個19bp長的片段，將Tnp和任意DNA序列包含在其中。
• 常見的末端有三種：外末端（outside end / OE），內(nèi)末端（inside end / IE）和鑲嵌性尾端（mosaic end / ME）。組合方式有兩個反向的OE，或者兩個反向的IE，或兩個反向的ME，又或是兩組反向的 OE和IE組合

（2） Tn5轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)

Tn5轉(zhuǎn)座子由兩個反向的插入片段 IS50 以及兩組 OE 和 IE 構(gòu)成

• IS50 包括三個抗生素抗性基因。 IS50R 負責編碼 Tnp 和轉(zhuǎn)座抑制物（Inh），而 IS50L 負責編碼兩個低活性蛋白

IS（insertion sequence）： 插入序列，很小（< 2.5 kb）DNA片段，可以在不同的基因位點跳躍，或自我復(fù)制。通常存在于細菌與古細菌基因中，但也存在于真核生物的轉(zhuǎn)座元素中。編碼的基因一般只與移動有關(guān)。

2. 轉(zhuǎn)座酶

• Tn5 Tnp是一種轉(zhuǎn)座酶，可以將DNA片段從一個位置移動到另一個位置，來自大腸桿菌，全長477個氨基酸。
• Tn5 Tnp可以與特異性DNA識別和結(jié)合，特異性DAN是指Tn5或IS50的末端反向重復(fù)序列。
• Tn5 Tnp的主要功能區(qū)有三個，N末端、催化結(jié)構(gòu)域和C末端：
  1. N末端是特異性結(jié)合DNA結(jié)構(gòu)域，可以識別和結(jié)合Tn5或IS50的末端反向重復(fù)序列
  2. 催化結(jié)構(gòu)域是轉(zhuǎn)座反應(yīng)的核心，可以切割和連接DNA，并形成雙聚體
  3. C末端是合成復(fù)合體的必需部分，可以促進Tn5 Tnp之間的相互作用，并影響轉(zhuǎn)座效率

3. 轉(zhuǎn)座過程

Tn5轉(zhuǎn)座對目標DNA的特異性要求不高，可以插入到任何雙鏈DNA上。但是，Tn5也有一些偏好性，比如傾向于插入到AT富的區(qū)域，或者靠近某些特定的序列。Tn5轉(zhuǎn)座酶（Tnp）的突變也可以改變其對目標DNA的結(jié)合特異性和親和力

二、數(shù)據(jù)比對和過濾