何首烏中UDP-鼠李糖合成酶基因FmRHM1/2的克隆與鑒定

摘要

UDP-鼠李糖是一種由UDP-鼠李糖合酶（RHM）催化合成的鼠李糖供體，而鼠李糖是鼠李糖苷化合物的重要組成部分，植物中只有少數(shù)基因編碼的酶參與UDP-鼠李糖生物合成。本研究基于何首烏（Fallopia multiflora（Thunb.）Harald.）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，首次克隆得到2個(gè)RHM基因（FmRHM1和FmRHM2），并進(jìn)行生物學(xué)信息分析、體外功能鑒定及組織特異性分析。結(jié)果顯示FmRHM1/2基因的開放閱讀框均為2013 bp，均編碼670個(gè)氨基酸，推測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量均為75.6 kDa，理論等電點(diǎn)分別為6.20和7.19，具有RHM酶家族的特征信號序列（GxxGxxG/A和YxxxK）；多序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，FmRHM與其他物種的RHM具有同源性。體外酶促反應(yīng)結(jié)果顯示，重組蛋白FmRHM1和FmRHM2均具有催化活性，可將UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)化為UDP-鼠李糖。組織特異性表達(dá)顯示，FmRHM1和FmRHM2基因在根中的表達(dá)量最低，并與莖和葉相比均存在顯著性差異。本研究首次報(bào)道了何首烏RHM，并驗(yàn)證了其催化功能，為進(jìn)一步研究微生物合成UDP-鼠李糖奠定基礎(chǔ)。

UDP-鼠李糖(UDP-Rha)是合成L-鼠李糖及苷的重要糖供體,?L-鼠李糖是植物細(xì)胞壁果膠多聚糖RG-Ⅰ和RG-Ⅱ生物合成所必需的組分之一。植物中的鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶通過糖苷鍵將活化的鼠李糖與小分子連接起來[1], 構(gòu)成的鼠李糖多糖參與植物細(xì)胞壁的形成, 在維管植物的生長及發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[2]; 細(xì)菌細(xì)胞表面多糖也含有鼠李糖, 對細(xì)胞生長和細(xì)菌間的相互作用起著重要作用[2]。UDP-Rha是黃酮類、皂甙類、三萜類和小酚類化合物等次生代謝物的糖苷類化合物合成的糖基供體[3]; 研究表明, 鼠李糖苷具有廣泛的生物活性, 如抗炎作用[4]、抗病毒活性[5]、抗氧化作用[6]和抗癌作用[7]。自然界中至少存在兩種形式核苷酸鼠李糖: dTDP-Rha和UDP-Rha[8,?9], dTDP-Rha存在于細(xì)菌中, 而UDP-Rha存在于真菌和植物中。在細(xì)菌中, 由dTDP-葡萄糖4, 6-脫水酶(RmlB)[10]、dTDP-4-酮-6-脫氧-D-葡萄糖3, 5-差向異構(gòu)酶(RmlC)[11]和dTDP-4-酮-L-鼠李糖4-酮-還原酶(RmlD)[12]基因編碼的3種酶連續(xù)催化dTDP-葡萄糖生成dTDP-Rha (圖 1A)。真菌中則通過兩種酶: UDP-葡萄糖4, 6-脫水酶(UG4, 6-Dh)和UDP-4-酮-6-脫氧-D-葡萄糖(UDP-4K6DG) 3, 5-差向異構(gòu)酶-4-酮-還原酶通過兩步催化合成UDP-Rha[13]?(圖 1B)。而植物中, 則存在一種同時(shí)具有UG4, 6-Dh、UDP-4K6DG 3, 5-差向異構(gòu)酶和UDP-4-酮-L-鼠李糖(UDP-4KR)4-酮-還原酶活性的單酶, UDP-鼠李糖合成酶(RHM)整合了細(xì)菌dTDP-Rha生物合成途徑中3種酶的功能, 直接催化底物UDP-α-D-葡萄糖(UDP-Glc)生成UDP-Rha (圖 1C)。植物RHM由兩個(gè)功能不同的結(jié)構(gòu)域組成:分別是具有UG4, 6-Dh活性的N-末端和具有UDP-4K6DG 3, 5-差向異構(gòu)酶和UDP-4KR 4-酮-還原酶活性的C-末端結(jié)構(gòu)域[2]。

RHM是植物中控制鼠李糖苷合成途徑中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)酶, 將UDP-Glc轉(zhuǎn)化為UDP-Rha, 并作為糖基供體, 用于鼠李糖分子類化合物的生物合成。目前已有化學(xué)合成和酶法合成UDP-Rha, 但在化學(xué)合成上無論是利用磷酸-鼠李糖與活化的核苷5'-單磷酸(NMP)進(jìn)行偶聯(lián)[14], 還是利用核苷二磷酸(NDP)與親電子糖基供體反應(yīng), 在其末端磷酸上發(fā)生糖基化生成UDP-Rha[15], 都存在反應(yīng)條件苛刻、反應(yīng)效率和立體選擇性低等問題, 實(shí)際應(yīng)用價(jià)值有限。酶法合成是通過相關(guān)蛋白催化產(chǎn)物生成, 具有簡單、快速、副產(chǎn)物少等優(yōu)勢, 已逐漸成為一種理想的替代化學(xué)合成的途徑。目前, 已有報(bào)道利用擬南芥[2]、楊樹[16]、玉米[17]等植物中的RHM酶, 以UDP-Glc為底物連續(xù)催化合成UDP-Rha的研究, 但在中藥領(lǐng)域中卻未見相關(guān)研究報(bào)道。

何首烏[Fallopia multiflora?(Thunb.) Harald.]是我國著名的傳統(tǒng)中藥, 含有多種對人體有益的活性成分, 具有抗衰老、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗高血脂、抗腫瘤、抗炎、清除自由基、保肝等方面的生物活性[18]。何首烏中存在2, 3, 5, 4'-四羥基二苯乙烯-2-O-鼠李糖苷和槲皮素7-O-鼠李糖苷[19], 這暗示何首烏中存在RHM, 催化UDP-Rha的合成, 以提供鼠李糖糖基, 用于鼠李糖苷類化合物的生物合成。目前為止, 尚未有何首烏鼠李糖合成酶基因(FmRHM)的相關(guān)報(bào)道。本文通過何首烏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選, 首次克隆得到2條RHM基因(FmRHM1和FmRHM2)的全長cDNA序列, 并在體外進(jìn)行原核表達(dá)獲得重組蛋白; 通過以槲皮素、UDP-Glc、FmRHM基因和擬南芥AtUGT78D1編碼的酶進(jìn)行酶促反應(yīng), 檢測槲皮素-3-O-鼠李糖苷的生成[16], 以鑒定FmRHM的體外功能。其次, 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測這兩個(gè)基因在何首烏不同組織中的表達(dá)水平。何首烏中RHM基因功能的成功鑒定, 為合成生物學(xué)和代謝工程提供更多的植物基因用于微生物合成UDP-Rha, 為鼠李糖多糖及糖苷的生物合成奠定了基礎(chǔ)。

材料與方法

材料

??樣品采自廣東省德慶縣大橋村, 經(jīng)廣東藥科大學(xué)楊全教授鑒定為蓼科植物何首烏(F.?multiflora)。取其根、莖、葉組織樣品, 液氮速凍后置-80 ℃保存?zhèn)溆?。用根、莖、葉提取總RNA, 檢測FmRHM基因在不同組織中的特異性表達(dá)。所用的克隆、表達(dá)大腸桿菌(Escherichia coli)?Transl-T1、Transetta?(DE3)均購自全式金(TransGen Biotech, China)公司, 原核表達(dá)載體pET-28a (+)由實(shí)驗(yàn)室傳代凍存。引物合成及片段測序送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司(Tsingke, China)進(jìn)行。擬南芥AtUGT78D1基因在GenBank的登錄號為AY056312.1, 序列送蘇州泓迅生物科技有限公司合成。槲皮素、槲皮素3-O-葡萄糖苷、槲皮素3-O-鼠李糖苷均購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

何首烏總RNA的提取與cDNA的合成

??按照RNAprep Pure試劑盒(Tiangen, China)操作說明提取何首烏總RNA, 利用Nano-100檢測RNA濃度和純度, 同時(shí)利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa, Japan)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為第一鏈(cDNA), -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

FmRHM基因序列全長克隆

??根據(jù)從何首烏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選的2條FmRHM基因序列, 設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物, 設(shè)計(jì)原理基于pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit (TransGen Biotech, China)說明書, 分別在一對引物的5'端引入一段和線性化載體(pET28a)兩端相同的序列(引物序列見表 1)。利用擴(kuò)增試劑盒(TOYOBO, Japan), 以何首烏RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板, 進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增FmRHM基因片段。PCR反應(yīng)體系為: cDNA 1 μL, KOD-Plus-Neo (1 U·μL-1) 1 μL, 10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5 μL, 2 mmol·L-1?dNTPs 5 μL, 25 mmol·L-1?MgSO4?3 μL, 10 μmol·L-1上下游引物各1.5 μL, ddH2O補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序: 94 ℃預(yù)變性2 min; 94 ℃變性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 35個(gè)循環(huán)后; 72 ℃延伸10 min; 4 ℃保存。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物, 利用TaKaRa膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。使用無縫克隆試劑盒(TransGen Biotech, China), 將PCR產(chǎn)物與BamH Ⅰ酶切后的pET28a載體連接。轉(zhuǎn)化到Transl-T1菌株中, 在含卡那霉素抗性的平板上進(jìn)行篩選, 并經(jīng)過菌落PCR檢測后送擎科公司測序。

何首烏FmRHM1和FmRHM2的生物信息學(xué)分析

??利用ExPASy Proteomics Server在線軟件Protparam對2個(gè)FmRHM基因編碼蛋白的氨基酸組成、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)及穩(wěn)定性等理化性質(zhì)進(jìn)行分析; 通過SOPMA預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu); 利用SWISS-MODEL在線軟件構(gòu)建FmRHM1和FmRHM2蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型; 在線軟件TMHMM 2.0進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)分析; 將所獲得的FmRHM編碼的氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行蛋白Blast比對分析, 通過DNAMAN軟件與其他物種的RHM基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析; 通過MEGA 6.0軟件構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹, 進(jìn)化距離的計(jì)算采用泊松校正法, Bootstrap重復(fù)次數(shù)為1 000次。

FmRHM蛋白原核表達(dá)

??挑選測序驗(yàn)證后的轉(zhuǎn)化子, 過夜培養(yǎng), 提取pET28a-FmRHM重組質(zhì)粒, 轉(zhuǎn)化Transetta?(DE3)感受態(tài)大腸桿菌中培養(yǎng)。挑取陽性克隆進(jìn)行PCR檢測, 并送測序驗(yàn)證表達(dá)系統(tǒng)正確性。挑選序列正確菌株, 按1：100比例加入到適量含有50 μg·mL-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中; 37 ℃、250 r·min-1振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6~1.0左右; 加IPTG至終濃度0.4 mmol·L-1, 30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)細(xì)胞5 h, 誘導(dǎo)產(chǎn)生重組FmRHM蛋白。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)物, 以4 000 ×g離心15 min收集菌體, 用ddH2O清洗菌體2次后, 菌體懸浮于緩沖液(50 mmol·L-1?Tris-HCl, 1 mmol·L-1?EDTA, 10%甘油, 1 mmol·L-1?PMSF)中, 超聲破碎(30%功率, 超聲5 s, 間歇5 s, 工作5 min)。細(xì)胞破碎液于4 ℃、13 000 r·min-1離心15 min, 去除細(xì)胞碎片。取粗酶液加入6×loading buffer混勻, 沸水浴5 min, 12 000 ×g離心5 min, 上樣10 μL進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳, 電泳結(jié)束后將膠置于考馬斯亮藍(lán)染色1 h, 用脫色液進(jìn)行背景脫色, 檢測蛋白表達(dá)情況。

擬南芥AtUGT78D1表達(dá)載體構(gòu)建及體外表達(dá)

??將AtUGT78D1連接到BamH Ⅰ和Not?Ⅰ酶切的pET28a載體上, 構(gòu)建重組表達(dá)載體?？寺【陻U(kuò)大培養(yǎng), 提取重組質(zhì)粒, 轉(zhuǎn)化到Transetta?(DE3)中培養(yǎng), 挑選陽性克隆菌, 按上述項(xiàng)下的操作進(jìn)行AtUGT78D1重組蛋白的體外原核表達(dá)及蛋白提取, 并進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳檢測。

酶促反應(yīng)檢測

??酶促反應(yīng)體系:總體積為400 μL, 含有0.1 mmol·L-1槲皮素、0.5 mmol·L-1?UDP-Glc、0.5 mmol·L-1?NADPH、0.5 mmol·L-1?NAD+、AtUGT78D1和FmRHM粗酶液各193 μL。以未連接目的基因的pET28a空載表達(dá)菌在同等表達(dá)條件下的蛋白粗提物進(jìn)行酶促反應(yīng)作為陰性對照?；靹蚝笥?0 ℃下孵育12 h, 加入等體積甲醇終止反應(yīng)。13 000 r·min-1離心30 min, 取上清過0.22 μm濾膜, 進(jìn)行HPLC檢測。檢測條件如下: Waters 1525高效液相色譜儀系統(tǒng); 色譜柱: Phenomenex 00G-4252-E0 (4.6 mm×250 mm, 0.45 μm); 流動(dòng)相:甲醇-0.1%磷酸溶液(55：45,?v/v); 流速: 1 mL·min-1; 進(jìn)樣體積: 10 μL, 30 ℃柱溫, 366 nm的波長下進(jìn)行檢測。

何首烏FmRHM基因的組織特異性表達(dá)分析

??利用qRT-PCR方法檢測何首烏FmRHM基因在不同組織中的表達(dá)水平。使用TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTM?RT reagent Kit with gDNA Eraser)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄生成單鏈cDNA。使用TB GreenTM?Premix?Ex TaqTM?Ⅱ試劑盒(TaKaRa, Japan), 在CFX96 Touch (BioRad, USA)儀上進(jìn)行擴(kuò)增。選取何首烏Actin基因作為目標(biāo)基因定量表達(dá)的內(nèi)參基因, 利用Integrated DNA technologies在線軟件設(shè)計(jì)引物, 引物序列見表 1。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù), 重復(fù)3次。擴(kuò)增體系中含有10 μL TB Green?Premix Ex Taq?Ⅱ (2×)、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL、模板2 μL, ddH2O補(bǔ)至總體積為20 μL。反應(yīng)程序: 95 ℃預(yù)變性30 s; 95 ℃變性5 s, 60 ℃退火/延伸30 s, 40個(gè)循環(huán)后; 95 ℃變性10 s, 65~95 ℃做熔解曲線分析, 每個(gè)溫度以每步0.5 ℃上升, 每個(gè)溫度停留5 s。根據(jù)熔解曲線判斷RT-PCR產(chǎn)物的特異性, 相對定量分析采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行, 結(jié)果采用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行各組間方差分析。

結(jié)果與分析

1 何首烏FmRHM基因全長cDNA克隆

以何首烏cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增, 通過PCR擴(kuò)增后, 2條基因的PCR產(chǎn)物均約為2 000 bp, 與預(yù)期大小相近, 如圖 2所示。將純化后的PCR產(chǎn)物連接到pET28a載體上, 進(jìn)行測序。測序結(jié)果顯示克隆的片段與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的基因序列一致, 其序列長度均為2 013 bp, 均編碼670個(gè)氨基酸, 基因命名為FmRHM1和FmRHM2。

2 FmRHM1和FmRHM2生物信息學(xué)分析

2.1 FmRHM1和FmRHM2理化性質(zhì)分析、亞細(xì)胞定位、跨膜區(qū)域分析

通過Protparam軟件預(yù)測重組蛋白的理化性質(zhì)(表 2), 推測的FmRHM1和FmRHM2編碼的蛋白均屬于穩(wěn)定和親水性蛋白; 且TMHMM 2.0預(yù)測顯示何首烏FmRHM1和FmRHM2蛋白均無跨膜區(qū)域。

2.2 FmRHM1和FmRHM2蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

結(jié)果顯示, 預(yù)測FmRHM1和FmRHM2基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)由無規(guī)則卷曲(random coil)、α-螺旋(α-helices)、延伸鏈(extended strand)和β-折疊(β-turn)組成(圖 3), 且大部分由無規(guī)則卷曲和α-螺旋組成(表 3), 推測兩者是其主要的二級結(jié)構(gòu)元件, 同時(shí)α-螺旋、β-折疊和延伸鏈散布于整個(gè)蛋白中。

將FmRHM1和FmRHM2的氨基酸序列通過SWISSMODEL Workspace在線分析軟件建立三維結(jié)構(gòu)模型, 選擇AtRHM (PDB No.: 4QQR)的蛋白結(jié)構(gòu)為模板[20], 對FmRHM1和FmRHM2結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測, 所得三維結(jié)構(gòu)如圖 4所示。兩個(gè)蛋白與AtRHM蛋白的相似度分別為82%和83%, 因FmRHM1和FmRHM2的氨基酸序列相似度很高, 所以在蛋白三維結(jié)構(gòu)模型上較難看出區(qū)別。

2.3 何首烏FmRHM氨基酸序列和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將何首烏FmRHM氨基酸序列與GenBank蛋白數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源比對, 通過DNAMAN軟件與多種植物進(jìn)行多序列比對分析, FmRHM1和FmRHM2與其他物種RHM同源性很高, 達(dá)85%以上。將FmRHM1和FmRHM2與擬南芥、虎眼萬年青、茶樹的RHM進(jìn)行詳細(xì)比對, 發(fā)現(xiàn)FmRHM與這些植物RHM的N-端和C-端高度相似, 而這兩個(gè)功能單元, 在擬南芥RHM2的體外酶活性分析發(fā)現(xiàn), N-端區(qū)具有較強(qiáng)的UDP-葡萄糖4, 6-脫水酶活性, 而C-端區(qū)域則同時(shí)具有UDP-4K6DG 3, 5-差向異構(gòu)酶和UDP-4KR 4-酮-還原酶活性[21]。且FmRHM1和FmRHM2每個(gè)功能單元中均存在NADP(H)結(jié)合位點(diǎn)(GxxGxxG/A)和類似RmlD酶結(jié)構(gòu)的活性中心, 即YxxxK模序(圖 5)。

為了進(jìn)一步了解何首烏FmRHM1/2蛋白在植物RHM家族中的進(jìn)化位置, 將FmRHM1/2與NCBI中51條RHM氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析, 其中包括細(xì)菌、真菌、蕨類植物和苔蘚門, 以及植物中RHM序列, 包括喬木類植物甜橙、葡萄等, 模式植物擬南芥, 以及其他植物如大豆、虎眼萬年青等, 利用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明, 不同來源的RHM最后聚為一支, 表明其具有共同的祖先, 且在被子植物中分為雙子葉植物和單子葉植物兩類, 何首烏中的2個(gè)RHM均歸屬于雙子葉植物一類; 另外, FmRHM2與雙子葉植物陸地棉距離較近, 而FmRHM2則單獨(dú)聚為一支(圖 6)。

3 FmRHM與AtUGT78D1原核表達(dá)分析

本研究用pET28a為表達(dá)載體, 利用同源重組原理構(gòu)建pET28a-FmRHM重組原核表達(dá)載體, 并轉(zhuǎn)化Transetta?(DE3)感受態(tài)大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明, 經(jīng)誘導(dǎo)后, 與未連接目的基因的pET28a空載誘導(dǎo)蛋白及未誘導(dǎo)的含目的基因載體表達(dá)的蛋白對比。在約70 kDa和52 kDa附近, 誘導(dǎo)樣品6、7和8出現(xiàn)明顯的蛋白條帶(圖 7)。FmRHM1和FmRHM2的預(yù)測分子質(zhì)量大小均約為75 kDa, AtUGT78D1的預(yù)測分子質(zhì)量約為50 kDa, 所以這3個(gè)蛋白條帶分別為誘導(dǎo)表達(dá)的FmRHM重組蛋白和AtUGT78D1重組蛋白。

4 FmRHM酶促反應(yīng)檢測

在酶促反應(yīng)液中加入U(xiǎn)DP-鼠李糖合成酶和糖基轉(zhuǎn)移酶共同反應(yīng), 檢測反應(yīng)液中糖苷的形成。HPLC檢測結(jié)果顯示(圖 8), 所有樣品均在保留時(shí)間約為4.17 min處出現(xiàn)色譜峰, 與標(biāo)準(zhǔn)品中的槲皮素-3-O-葡萄糖苷(S1)的出峰時(shí)間相近, 說明反應(yīng)液中均生成槲皮素-3-O-葡萄糖苷; 在槲皮素(S3)的出峰時(shí)間8.48 min處未見明顯峰, 說明槲皮素大部分已被AtUGT78D1酶轉(zhuǎn)化為糖苷, 所以檢測量較低; 更重要的是, 重組表達(dá)質(zhì)粒組與空載對照組相比, FmRHM1和FmRHM2組均在保留時(shí)間約為5.10 min處出現(xiàn)明顯色譜峰, 與槲皮素-3-O-鼠李糖苷(S2)的出峰時(shí)間一致, 對照組卻未在此出現(xiàn)明顯峰, 證明重組質(zhì)粒組的反應(yīng)液中生成了UDP-Rha, 從而使AtUGT78D1酶能利用除UDP-Glc外的UDP-Rha為糖基供體, 生成槲皮素3-O-鼠李糖苷。結(jié)果驗(yàn)證了所得FmRHM重組蛋白均具有生物學(xué)活性, 可在體外催化UDP-Glc轉(zhuǎn)化生成UDP-Rha。

5?FmRHM基因組織特異性表達(dá)分析

采用qRT-PCR方法分析FmRHM1和FmRHM2基因在何首烏不同組織(包括根、莖、葉)中的相對表達(dá)量,?圖 9表示兩個(gè)基因在根、莖、葉中的相對表達(dá)水平,?FmRHM1和FmRHM2在根中的表達(dá)量均最低。盡管FmRHM1和FmRHM2編碼的蛋白在體外具有相同功能, 但它們的表達(dá)水平是不同的。顯著性差異分析結(jié)果顯示,?FmRHM1在莖、葉中的表達(dá)水平與根之間的差異均具有顯著性, 但莖葉間的相對表達(dá)量相近, 差異不顯著; 而FmRHM2在不同組織間的表達(dá)水平均存在顯著性差異, 表達(dá)量呈現(xiàn)葉 > 莖 > 根的結(jié)果。

討論

鼠李糖是許多天然有效產(chǎn)物的一部分, UDP-Rha是一種活化形式的L-鼠李糖, 參與鼠李糖苷的生物合成, RHM是植物鼠李糖合成的關(guān)鍵酶。目前, 尚未有何首烏中關(guān)于RHM基因的相關(guān)研究, 本研究首次在從何首烏中擴(kuò)增得到2個(gè)RHM基因(FmRHM1和FmRHM2)全長, 并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析; 以擬南芥中RHM蛋白為模板進(jìn)行同源建模, 構(gòu)建了FmRHM1和FmRHM2蛋白的三維結(jié)構(gòu); 多序列比對分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)FmRHM含有植物中RHM的2個(gè)高度保守結(jié)構(gòu)(GxxGxxG/A和YxxxK), GxxGxxG/A是酶促反應(yīng)輔因子NADP(H)的結(jié)合模序, 而輔因子NAD+則結(jié)合YxxxK結(jié)構(gòu), 有趣的是在序列的N-端和C-端均存在這兩種結(jié)構(gòu), 暗示所得的兩個(gè)FmRHM均具有將UDP-Glc轉(zhuǎn)化為UDP-Rha的催化能力; 進(jìn)化分析結(jié)果表明FmRHM與其他物種RHM存在同源性。另外, 本研究通過構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-FmRHM, 誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白, 并通過加入FmRHM和擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行酶促反應(yīng)檢測鼠李糖苷的生成, 證實(shí)了表達(dá)的FmRHM蛋白具有催化合成UDP-Rha的功能。植物中含糖類化合物的生物合成存在許多未知, 因此, 采用qRT-PCR方法研究FmRHM基因在何首烏不同組織中的表達(dá)水平, 旨在探討RHM在鼠李糖類小分子化合物生物合成中可能存在的作用。數(shù)據(jù)顯示何首烏RHM基因存在組織特異性表達(dá), 且FmRHM1和FmRHM2在不同組織中的表達(dá)水平不同, 總體來說, 在葉和莖中均表現(xiàn)出較高的表達(dá)量, 暗示RHM基因可能參與某種鼠李糖類化合物的合成, 在葉和莖發(fā)育過程中起主要作用。

目前, 通過生物合成核苷酸糖的實(shí)際應(yīng)用還很少, 并且合成方法還不夠完善, 如UDP-Xyl[22]合成過程中存在需要多種酶參與, 反應(yīng)步驟多, 反應(yīng)效率較難控制, 合成費(fèi)用高等問題。然而, 在本研究中所提出的何首烏基因所編碼的酶, 只需要單酶參與反應(yīng)便能合成UDP-Rha。作為鼠李糖基供體, UDP-Rha是鼠李糖苷生物合成所必需的, 也是植物細(xì)胞壁組成中不可缺少的。毫無疑問, 這兩個(gè)基因的成功鑒定為全面分析含鼠李糖多糖的生物合成途徑奠定了良好的基礎(chǔ), 提供了一種簡單快速合成UDP-鼠李糖的方法, 目前該技術(shù)尚未在商業(yè)上使用。本研究闡述了利用植物基因合成小分子糖苷的方法, 為天然產(chǎn)物鼠李糖苷的生物合成奠定基礎(chǔ)。