Chemoenzymatic Synthesis of Fluorinated Mycocyclosin Enabled by the Engineered Cytochrome P450-Catalyzed Biaryl Coupling Reaction

經(jīng)工程化的細胞色素P450催化的聯(lián)芳基偶聯(lián)反應(yīng)實現(xiàn)氟代麥環(huán)素的化學酶促合成

摘要

將氟原子引入天然產(chǎn)物有望生成具有改良或新穎藥理特性的氟代分子。酶促氧化的碳-碳偶聯(lián)反應(yīng)是合成聯(lián)芳結(jié)構(gòu)的一種簡單策略，但利用該方法生產(chǎn)氟取代天然產(chǎn)物衍生物的探索仍不充分。在本研究中，我們報道了通過蛋白質(zhì)工程改造來源于結(jié)核分枝桿菌的細胞色素P450（MtCYP121），用于構(gòu)建一系列具有自然界中新穎氟取代麥環(huán)素的衍生物。該方法利用了一種“混合”化學酶促程序，包括酪氨酸苯酚裂解酶催化的氟酪氨酸合成（以市售氟代苯酚為原料）、分子間化學縮合生成二酪氨酸、以及經(jīng)工程化的MtCYP121催化的分子內(nèi)雙酚偶聯(lián)反應(yīng)，以完成張力大的大環(huán)結(jié)構(gòu)。計算機制研究表明，MtCYP121通過Cpd I從底物的近端酚羥基抽取氫原子以觸發(fā)反應(yīng)。隨后構(gòu)象變化使得兩個酚羥基足夠靠近，在一個水分子的幫助下發(fā)生分子內(nèi)氫原子轉(zhuǎn)移。最終的雙自由基偶聯(lián)過程完成了分子內(nèi)C–C鍵的形成。研究發(fā)現(xiàn)，生物芳基偶聯(lián)反應(yīng)的效率受不同氟取代影響，主要是由于不同的結(jié)合構(gòu)象所致。

引言

引入氟原子到有機小分子中，通常能夠改善其物理化學和藥代動力學性質(zhì)，從而提高藥物潛力。(1?5) 因此，有機合成領(lǐng)域的大量研究集中在開發(fā)新的試劑和氟化/氟烷基化反應(yīng)，以制備氟有機化合物。(6?10) 相比之下，生物催化策略在有機氟化學中的應(yīng)用較少，盡管它更符合綠色和可持續(xù)化學的原則。(11?13) 這可能是由于氟化物的生物毒性，(14,15) 氟化酶的稀缺，(16,17) 以及復(fù)雜的氟化物消除過程。(18,19) 為克服這一瓶頸，Süssmuth、Moore、Chang、O’Connor、Hailes和Grininger等研究團隊最近探索了酶的底物寬容性，通過前體定向生物合成為多種藥理學重要的天然產(chǎn)物（如生物堿、非核糖體肽和聚酮化合物）提供了氟化類似物的新途徑。(29) 盡管取得了顯著進展，通過合成化學和蛋白質(zhì)工程相結(jié)合的突變合成來拓展氟代天然產(chǎn)物衍生物的化學空間仍然不足，需進一步研究。(30?32)

聯(lián)芳結(jié)構(gòu)在許多天然產(chǎn)物、生物聚合物和藥物中頻繁出現(xiàn)。(33?36) 例如，次級代謝產(chǎn)物萬古霉素（一種糖肽類抗生素）、(37,38) 芳香霉素(39) 和麥環(huán)素(40) 都含有環(huán)內(nèi)的聯(lián)苯基團（圖1a，頂部）。近年來，對鹵素化天然產(chǎn)物的設(shè)計與合成越來越受到關(guān)注。(41) 例如，Wright等在2002年記錄了含有剛性七肽核心的氯代萬古霉素（A47934）的生物合成（圖1a，左側(cè)），(42) 而Molinaro等報道了通過工程化來源于鏈霉菌的細胞色素P450來實現(xiàn)分子內(nèi)氧化聯(lián)苯偶聯(lián)反應(yīng)，從而構(gòu)建溴代芳香霉素核心（圖1a，中間）。另一方面，麥環(huán)素是一種從結(jié)核分枝桿菌中分離得到的二肽次級代謝產(chǎn)物，由Belin及其同事于2009年發(fā)現(xiàn)。(40) 先前的研究表明，一種獨特的P450酶（CYP121）負責形成聯(lián)苯C–C鍵，從而構(gòu)建麥環(huán)素中的高度擁擠的大環(huán)骨架。(44?49) 然而，據(jù)我們所知，MtCYP121的蛋白質(zhì)工程研究尚未取得突破，特別是帶有鹵素原子修飾的非天然麥環(huán)素衍生物的結(jié)構(gòu)多樣性仍未充分探索（圖1a，右側(cè)）。在此背景下，我們開始了“混合”化學酶促合成氟代麥環(huán)素的項目（圖1b）。然而，需考慮多個挑戰(zhàn)。首先，所需反應(yīng)涉及環(huán)狀二肽的兩個芳香C–H鍵的直接氧化偶聯(lián)，以形成張力較大的大環(huán)。(50?54) 其次，引入氟原子到苯酚中將使苯環(huán)相對電子缺乏，從而增加氧化C–C交叉偶聯(lián)反應(yīng)的難度。(55,56) 此外，在P450酶催化的氧化條件下，常觀察到氟的消除。(18,19) 為解決這些潛在問題，我們首先提出了一種新的級聯(lián)化學酶促途徑，以繞過依賴tRNA的環(huán)肽合成酶用于二肽合成（圖1b，底部）。(57) 其次，我們設(shè)想通過MtCYP121的定向進化重新塑造其催化口袋，可能提高對非天然氟代底物的選擇性和活性。(58?61) 此外，Liu等最近披露了MtCYP121通過催化過氧化物旁路路徑執(zhí)行二酪氨酸的分子內(nèi)C–C交叉偶聯(lián)反應(yīng)。(62,63) 鑒于P450的“過氧化物旁路路徑”可使用低成本的過氧化氫（H2O2）作為氧和電子供體，從而無需昂貴的NADPH和復(fù)雜的氧化還原伙伴激活雙氧，(64?68) 我們計劃采用CYP121–H2O2系統(tǒng)來研究聯(lián)苯偶聯(lián)反應(yīng)。在此，我們報道了一個化學酶促平臺的發(fā)展，用于從簡單氟代苯酚出發(fā)，在制備規(guī)模上合成一系列氟取代麥環(huán)素衍生物（圖1b，底部）。定向進化的細胞色素P450確定了一種MtCYP121雙突變體（Q385A/A167M），能夠高效催化聯(lián)苯C–C鍵的形成，從而完成具有挑戰(zhàn)性的宏環(huán)核心。進一步進行了計算機制研究，以闡明反應(yīng)機制和氟取代的影響。

酶促氧化聯(lián)苯偶聯(lián)反應(yīng)以獲取含鹵聯(lián)苯基天然產(chǎn)物衍生物

結(jié)果與討論

氟取代二酪氨酸的制備

我們的研究從市售的氟代苯酚1出發(fā)，制備各種氟取代的二酪氨酸5（見圖2）。使用來自弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii，WP_086550791.1）的吡哆醛5-磷酸（PLP）依賴性酪氨酸苯酚裂解酶（TPL）作為酶，將苯酚與銨離子和丙酮酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酪氨酸。(69?71) 該實用方案表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性和良好的規(guī)?；瘽摿?#xff0c;如在Boc保護/脫保護步驟后，以適中分離收率和高純度制備出克級3-氟酪氨酸（2a）、2-氟酪氨酸（2b）、2,3-二氟酪氨酸（2c）和四氘代酪氨酸（2d）（實驗細節(jié)見支持信息）。隨后，Boc-酪氨酸3與酪氨酸-OMe 4在DCC（N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺）和Et3N的作用下發(fā)生分子間縮合，并經(jīng)甲酸脫保護，生成了一系列氟取代的二酪氨酸5，在克級規(guī)模上具有一般可接受的分離收率。兩個相同的氟酪氨酸（2a和2b）的偶聯(lián)可得到對應(yīng)的對稱二聚體5a和5f。或者，通過探索不同組合，可以增加環(huán)二肽的結(jié)構(gòu)多樣性，從而獲得單氟取代的二酪氨酸5b–5d，二氟取代的二酪氨酸5e和5g，三氟取代的二酪氨酸5h，以及四氟取代的二酪氨酸5i。

氟取代二酪氨酸5的制備（以氟代苯酚1a為原料）

制備模型底物2a的一般步驟：在5 L反應(yīng)器中加入醋酸銨（18.50 g，240.01 mmol，1.5倍當量）、吡哆醛磷酸（160.0 mg）、丙酮酸（42.24 g，479.67 mmol，3.0倍當量）和2-巰基乙醇（3.12 g，39.93 mmol，0.25倍當量）。然后加入4 L pH為7.4的100.0 mM PBS緩沖液和氟代苯酚1a（162.36 mmol，1.0倍當量），攪拌至所有反應(yīng)成分完全溶解。使用6.0 M NaOH將溶液pH調(diào)整至8.2，然后加入4.0 g粗酶粉CfTPL。得到的粗產(chǎn)物經(jīng)過Boc保護/脫保護步驟，得到氟酪氨酸2a。其他氟酪氨酸2b–2c和氘標記的2d按照此通用步驟制備。

制備模型底物5a的一般步驟：將2a（10.05 mmol，1.0倍當量）和MeOH（10 mL）混合物冷卻至0 °C，并用亞硫酰氯（1.78 g，15 mmol，1.5倍當量）處理，生成4a。然后，將3a（10.0 mmol，1.0倍當量）、4a（10.00 mmol，1.0倍當量）、DCC（2.06 g，10.0 mmol，1.0倍當量）溶于4:1 MeCN:DMF（50 mL），加入NEt3（1.01 g，10.0 mmol，1.0倍當量），在室溫下反應(yīng)，生成二酪氨酸5a。其他氟代二酪氨酸5b–5i也按照此通用步驟制備。實驗細節(jié)見支持信息。

反應(yīng)優(yōu)化和酶定向進化

在手中獲得了一系列氟取代的二酪氨酸后，我們接著探索酶促分子內(nèi)氧化C–C偶聯(lián)，以形成聯(lián)苯基連接。在自然界中，MtCYP121可催化二酪氨酸（cYY，環(huán)-(L-酪氨酸-L-酪氨酸)）轉(zhuǎn)化為麥環(huán)素，使用鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶系統(tǒng)以及NADPH（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）。(40) 使用環(huán)-(3-氟酪氨酸-3-氟酪氨酸) 5a作為模型底物，在H2O2存在下探測野生型MtCYP121（GenBank ID: ANZ82981.1）的反應(yīng)性（圖3a）。令人鼓舞的是，通過全面評估反應(yīng)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)目標分子內(nèi)偶聯(lián)反應(yīng)可以在NaHCO3/Na2CO3緩沖液（pH = 9.4，使用10% v/v DMSO作為共溶劑以提高底物溶解性）和60 mM H2O2（分批加入）的條件下進行（底物濃度為3 mM；篩選詳情見支持信息），盡管僅有34%的轉(zhuǎn)化率。用其他氧化劑如過乙酸（PAA）或二叔丁基過氧化物（DTBP）代替H2O2時，僅獲得約10%的5a轉(zhuǎn)化率。

模型反應(yīng)優(yōu)化與CYP121突變體的高通量篩選

為加速篩選大量蛋白變體庫，首先基于高效液相色譜（HPLC）分析中底物5a與產(chǎn)物6a的吸光度差異，建立了適合高通量的分析方法（圖3b，詳細信息見SI第2.6節(jié)）。(72,73) 確定315 nm為最佳波長，因為在此波長下反應(yīng)混合物的吸光度對不同底物濃度變化最大（圖3b-1）。在315 nm處，底物5a的峰幾乎消失，系統(tǒng)吸光度主要由產(chǎn)物6a的濃度貢獻（圖3b-2）。進一步分析確認了底物濃度與反應(yīng)混合物吸光度之間的線性關(guān)系[相關(guān)系數(shù)(R2)=0.97]（圖3b-3），表明通過在微孔板上監(jiān)測反應(yīng)混合物的吸光度可以確定底物5a的轉(zhuǎn)化率。HPLC中產(chǎn)物峰面積與反應(yīng)混合物吸光度的線性關(guān)系[相關(guān)系數(shù)(R2)=0.99]表明反應(yīng)混合物吸光度變化與產(chǎn)物6a的濃度密切相關(guān)（圖3b-4）。因此，基于這些分析和對背景干擾及空白對照實驗的評估，結(jié)果表明這種基于吸光度的高通量篩選（HTS）方法是檢測底物轉(zhuǎn)化率的可靠方法。此HTS方法可指示潛在的正突變體，之后通過克級實驗的HPLC分析確定精確的轉(zhuǎn)化率。

接下來，進行了多輪定向進化以提高MtCYP121在氧化偶聯(lián)二酪氨酸5a生成聯(lián)苯產(chǎn)物6a方面的活性。(74) 基于MtCYP121的晶體結(jié)構(gòu)（PDB: 3G5H）及先前的機制研究，(40,44?49) 首先構(gòu)建了位于催化活性位點周圍的三個關(guān)鍵位點（S237、Q385和R386）的位點飽和突變庫（圖3c-1，以往研究發(fā)現(xiàn)了底物二酪氨酸與S237、Q385、R386及水分子的特殊氫鍵網(wǎng)絡(luò)(40)）。通過在96孔板中進行快速篩選，發(fā)現(xiàn)Q385位的Gln突變?yōu)锳la可顯著提高5a的轉(zhuǎn)化率，從34%提升至克級實驗中的45%。隨后，利用位點飽和突變針對直接底物結(jié)合位點和水輔助的間接氫鍵結(jié)合位點（T77、V83、N85、M86、A178、N181和W182）生成蛋白變體（圖3c-2）。然而，未觀察到比野生型MtCYP121更高催化性能的變體。最后，通過在活性位點5 ?范圍內(nèi)的隨機突變篩選了其他變體：M62、V78、V82、V83、A167、F168、W182、V228、T229、G232、A233、F280和H343（圖3c-3），最終發(fā)現(xiàn)了幾個具有較高催化性能的雙突變體，包括Q385A/A167M（86%轉(zhuǎn)化率）、Q385A/G87A（69%轉(zhuǎn)化率）和Q385A/G87Q（82%轉(zhuǎn)化率）。進一步的組合突變生成了兩個三突變體（Q385A/A167M/G87Q和Q385A/A167M/G87A），但未見顯著活性提升（圖3c-4）。因此，通過三輪蛋白質(zhì)工程的迭代優(yōu)化，將目標氧化交叉偶聯(lián)反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率從34%逐步提高至86%（圖3c-4）。穩(wěn)態(tài)動力學分析表明，MtCYP121-M2變體催化氧化偶聯(lián)反應(yīng)的周轉(zhuǎn)數(shù)（kcat）為468.3 s?1，米氏常數(shù)（KM）為1.344 mM（野生型MtCYP121的kcat=233.8 s?1，KM=1.778 mM）。

底物范圍

接著，以MtCYP121-M2變體（Q385A/A167M）為模型，在優(yōu)化條件下對二酪氨酸5a–5i的底物寬容性進行了簡要探索（圖4）。單氟取代的麥環(huán)素衍生物6b在50%的cYY 5b轉(zhuǎn)化率下獲得。值得注意的是，此反應(yīng)中C–H鍵與C–D鍵的偶聯(lián)是可行的，生成了三氘代麥環(huán)素衍生物6c。(75,76) 在苯環(huán)3位含有一個氟原子的二酪氨酸5d對MtCYP121-M2的反應(yīng)性明顯較低，僅有微量轉(zhuǎn)化率。而含3-和2'位氟原子的底物5e表現(xiàn)出中等反應(yīng)性，含3-和3'位氟原子的5f則未檢測到轉(zhuǎn)化。這些結(jié)果表明2-位取代有利于氧化偶聯(lián)過程，而3-位取代不利。含有兩個氟原子的cYY 5g在一側(cè)苯環(huán)上轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的大環(huán)產(chǎn)物6g，轉(zhuǎn)化率為45%。值得注意的是，含有三氟原子的cYY 5h與MtCYP121-M2兼容性良好，生成對應(yīng)的三氟麥環(huán)素衍生物6h，轉(zhuǎn)化率為90%。最后，在標準條件下，未觀察到四氟化底物5i的轉(zhuǎn)化。

氟取代麥環(huán)素衍生物的底物范圍

一般步驟：向八個96深孔板的每孔中加入Q385A/A167M突變體的細菌溶液（800 μL，0.125 g/mL，Na2CO3/NaHCO3緩沖液，pH=9.4）、5a溶液（50 μL，3 mM，DMSO中）、6 U DNase I和1 mg/mL溶菌酶，以800 rpm在30 °C搖動，每隔30分鐘加入10 μL 600 mM的H2O2共10次。

為驗證此方法的實用性，對模型底物cYY 5a進行了克級反應(yīng)（圖5a）。如圖所示，100 mL H2O2通過注射泵緩慢加入到含有攪拌棒的1 L反應(yīng)混合物中。幾乎觀察到底物5a的完全轉(zhuǎn)化，經(jīng)過Bn保護-脫保護步驟后，得到高純度的產(chǎn)物6a，最終分離收率為251 mg/L（實驗細節(jié)見SI）。此外，將化合物6a與4-硝基芐溴處理得到保護產(chǎn)物7，收率為93%，并通過單晶X射線晶體學分析成功確認其結(jié)構(gòu)。

氟代麥環(huán)素衍生物的放大反應(yīng)及其X射線結(jié)構(gòu)

計算機制研究

麥環(huán)素的生成機制

基于分辨率為1.40 ?的結(jié)核分枝桿菌CYP121的X射線晶體結(jié)構(gòu)（PDB 3G5H），(40) 構(gòu)建了初始計算模型。首先，將整個系統(tǒng)溶解到半徑為37 ?的預(yù)平衡TIP3P水球中。隨后，使用CHARMM全原子力場及CHARMM程序進行40 ns的動態(tài)模擬以平衡系統(tǒng)。最終選擇40 ns時的快照用于后續(xù)的QM/MM計算。在QM/MM計算過程中，將系統(tǒng)分為兩個區(qū)域：QM區(qū)域和MM區(qū)域。QM區(qū)域包含軸向配體Cys345、Cpd I、底物（cYY）、兩個水分子（Wat285和Wat329）以及Ser237和Arg386的側(cè)鏈。QM區(qū)域通過量子力學描述，QM區(qū)域之外的其他原子（MM區(qū)域）則通過分子力學處理。QM/MM計算采用Chemshell軟件包，分別使用DL_POLY和TURBOMOLE程序計算MM和QM區(qū)域。計算細節(jié)詳見支持信息。

在雙重態(tài)下優(yōu)化的酶–底物復(fù)合物結(jié)構(gòu)如圖1a所示。底物cYY呈現(xiàn)出與晶體結(jié)構(gòu)（PDB 3G5H）一致的構(gòu)象。(40) 在水分子Wat285的輔助下，Cpd I可以輕松從底物cYY的近端酚羥基中抽取氫原子，生成自由基中間體IM1，其對應(yīng)的能壘為10.6 kcal/mol（圖1b,c）。接下來，考慮內(nèi)部氫原子轉(zhuǎn)移過程以生成遠端酚自由基。(47,62,77?79) 然而，由于兩個酚羥基之間的距離較遠，此步驟具有較大的難度。在此背景下，IM1的構(gòu)象變化被認為參與了后續(xù)反應(yīng)。(80) 估計此構(gòu)象變化在酶的活性位點中具有約6.0 kcal/mol的較低能壘，對應(yīng)的中間體IM2的相對能量與IM1相似（圖1d和圖2a）。發(fā)現(xiàn)自由底物的構(gòu)象變化僅對應(yīng)約5.0 kcal/mol的能壘。

(a) 酶–底物復(fù)合物的優(yōu)化結(jié)構(gòu)，記為R。 (b) 通過氫原子抽取生成的自由基中間體（IM1）。 (c) 氫原子抽取的能量曲線。 (d) 構(gòu)象調(diào)整后的自由基中間體（IM2）。

(a) 分子內(nèi)氫原子轉(zhuǎn)移和C–C偶聯(lián)的計算能量曲線。 (b) 分子內(nèi)氫原子轉(zhuǎn)移過程中過渡態(tài)和中間體的優(yōu)化結(jié)構(gòu)。

在生成IM2后，發(fā)生分子內(nèi)氫原子從遠端酚羥基轉(zhuǎn)移至近端氧自由基，從而激活遠端芳香環(huán)。根據(jù)我們的計算結(jié)果，IM2的分子內(nèi)氫原子轉(zhuǎn)移需要一個口袋水分子（Wat329）的輔助，并對應(yīng)一個20.0 kcal/mol的能壘，生成遠端酪氨酸自由基中間體IM3（圖2）。在先前的研究中，(47,62) 曾建議IM3的生成可能遵循PCET機制。然而，我們發(fā)現(xiàn)自旋分布數(shù)據(jù)支持氫轉(zhuǎn)移過程。在接下來的步驟中，Fe(IV)–OH（Cpd II）從近端羥基中抽取氫，生成雙自由基中間體IM4。值得注意的是，IM4中的兩個自由基在整個芳香環(huán)上離域，從而發(fā)生雙自由基偶聯(lián)并形成C–C鍵。我們的計算表明，分子內(nèi)氫原子轉(zhuǎn)移（從IM2到IM3）是速率限制步驟。IM5的最終芳構(gòu)化過程被計算為非酶促反應(yīng)，可通過弱堿催化實現(xiàn)。

反應(yīng)機制中氟取代的效應(yīng)

根據(jù)我們的實驗結(jié)果，氟取代的二酪氨酸5a–5i在C–C偶聯(lián)反應(yīng)中的轉(zhuǎn)化率不同。特別是，在MtCYP121-M2變體（Q385A/A167M）催化下，底物5a（2,2′-雙氟取代）在生成6a時的轉(zhuǎn)化率最高（86%），而底物5f（3,3′-雙氟取代）則完全無活性。為了理解氟取代效應(yīng)的原因，我們首先計算了不同氟取代的二酪氨酸中IM2到IM3的分子內(nèi)氫原子轉(zhuǎn)移的能壘，這是速率限制步驟。然而，計算結(jié)果表明氟原子位置對反應(yīng)能壘沒有明顯影響（詳見支持信息）。通過檢查5a和5f的兩個芳香環(huán)的自旋分布，我們也沒有發(fā)現(xiàn)這兩種底物之間有顯著差異。因此，合理推測氟取代對IM2到IM3的分子內(nèi)氫原子轉(zhuǎn)移影響不大。

接下來，我們比較了天然底物cYY (5)和氟取代cYY 5a–5h在C–C鍵形成步驟的計算能壘，結(jié)果顯示沒有顯著差異（詳見支持信息）。在這一階段，我們進一步考慮了可能影響氟取代二酪氨酸反應(yīng)速率的其他因素。為對比，我們進一步使用5、5a和5f作為底物進行分子對接，并進行了MD模擬。結(jié)果顯示氟原子的位置確實對底物的結(jié)合構(gòu)象有顯著影響（詳見支持信息）。例如，2,2′-雙氟取代的底物5a與天然底物5相比，表現(xiàn)出幾乎相同的結(jié)合構(gòu)象（圖3）。然而，3,3′-雙氟取代的底物5f則表現(xiàn)出完全不同的結(jié)合構(gòu)象。這種構(gòu)象差異可能導致在相同的CYP121突變體催化下產(chǎn)生不同的反應(yīng)表現(xiàn)。這些初步結(jié)果表明，氟取代不會影響活性位點中底物的化學反應(yīng)性，但會通過構(gòu)象變化影響底物的動態(tài)性，最終影響整體的聯(lián)芳偶聯(lián)反應(yīng)效率。我們通過突變口袋殘基提高CYP121活性這一事實也支持了上述推測。

從100 ns的MD模擬中獲得的MtCYP121-M2變體（Q385A/A167M）與底物（5、5a、5f）復(fù)合物的最終平均結(jié)構(gòu)。

結(jié)論

總之，我們成功開發(fā)了一條化學酶促途徑，用于合成具有新穎性的氟代麥環(huán)素，其中包括兩個酶促反應(yīng)和一個化學縮合轉(zhuǎn)化。該方案的關(guān)鍵在于將細胞色素P450 MtCYP121工程化為雙突變體，使其能夠催化兩個C–H鍵的分子內(nèi)氧化偶聯(lián)形成一個C–C鍵，從而組裝出具有挑戰(zhàn)性的張力大環(huán)結(jié)構(gòu)。此酶促聯(lián)芳偶聯(lián)反應(yīng)使用廉價的H2O2作為終端氧化劑，接受多種二酪氨酸底物，并且可以順利放大至克級規(guī)模。計算機制研究揭示了反應(yīng)機制，包括Cpd I首先進行氫原子抽取、底物構(gòu)象變化、分子內(nèi)氫原子轉(zhuǎn)移（速率限制步驟）、Cpd II的第二次氫原子抽取，以及最終的雙自由基偶聯(lián)形成C–C鍵。我們的研究表明，底物的構(gòu)象變化在促進隨后的兩個羥基之間的分子內(nèi)氫原子轉(zhuǎn)移中起到了重要作用。氟取代可能導致不同的結(jié)合構(gòu)象，從而導致不同的聯(lián)芳C–C偶聯(lián)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。結(jié)構(gòu)上看，構(gòu)建合適的催化口袋以容納氟代底物并允許中間體的構(gòu)象變化，可能是進一步提高酶效率的關(guān)鍵。我們期待本研究不僅為具有挑戰(zhàn)性的聯(lián)芳分子的化學酶促合成開辟新的機會，還能為結(jié)核病領(lǐng)域的潛在藥物研究提供新穎的氟代化合物。