摘要

三萜皂苷(triterpenoids saponins)是由三萜皂苷元和一個或多個糖基和/或其他化學(xué)基團(tuán)縮合而成的一系列結(jié)構(gòu)多樣的天然化合物[1], 主要分布在五加科、蝶形花科、石竹科、桔?？?、毛茛科、玄參科、葫蘆科等植物中[2]. 植物中三萜皂苷常分布在特定的器官和組織, 如人參(Panax ginseng)、桔梗(Platycodon grandiflorus)的根, 麥藍(lán)菜(Vaccaria hispanica)的種子, 羅漢果(Siraitia grosvenori)的果實和積雪草(Centella asiatica)的莖、葉等部位均積累著豐富的三萜皂苷. 三萜皂苷元的骨架由30個碳原子構(gòu)成, 常見的為四環(huán)三萜和五環(huán)三萜, 其中最常見的三萜母核類型為達(dá)瑪烷型(dammarane)和齊墩果烷型(oleanane). 三萜皂苷不僅參與植物的通訊、防御和感覺調(diào)控, 還具有抗炎、抗癌、抗菌、抗病毒等多種生物活性[3,4]. 甘草(Glycyrrhiza uralensis)中的甘草酸、羅漢果中的羅漢果苷的甜味分別約為蔗糖的941倍和300倍[5,6], 可用作天然甜味劑. 此外, 三萜皂苷是一種兩親性化合物, 在水中可以形成穩(wěn)定的泡沫[7], 常被用于制作清潔劑、發(fā)泡劑和乳化劑等. 三萜皂苷的這些特性, 使其在醫(yī)藥、食品、日化、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注, 這均得利于三萜皂苷的結(jié)構(gòu)多樣性. 然而, 由于三萜皂苷結(jié)構(gòu)復(fù)雜、含量低, 使得直接提取、分離, 或通過化學(xué)合成等方法間接獲取三萜皂苷都相對困難, 限制了其廣泛應(yīng)用[8]. 利用生物技術(shù)對三萜皂苷生物合成途徑進(jìn)行研究, 從而提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物的含量, 或利用合成生物學(xué)方法生產(chǎn)三萜皂苷, 已成為當(dāng)前研究熱點. 現(xiàn)今在三萜皂苷生物合成途徑解析、轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制及微生物細(xì)胞工程方面取得了一定進(jìn)展, 進(jìn)一步闡明三萜皂苷生物合成的分子機(jī)制, 將有助于實現(xiàn)其在植物或微生物中的人工調(diào)控, 以提高產(chǎn)量. 因此, 本文總結(jié)了三萜皂苷生物合成途徑研究中的新技術(shù)、新方法, 綜述了三萜皂苷生物合成途徑、關(guān)鍵酶基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及三萜皂苷微生物細(xì)胞工程方面的最新進(jìn)展, 并對今后的發(fā)展方向進(jìn)行了展望, 以期為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供參考.

1 三萜皂苷生物合成途徑中的新技術(shù)和新方法

近年來, 隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展, 許多植物的基因組和轉(zhuǎn)錄組信息被在線解碼和發(fā)布, 為植物三萜皂苷合成途徑的解析提供了許多有價值的信息. 多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析或利用大數(shù)據(jù)發(fā)掘三萜皂苷生物合成相關(guān)基因已成為當(dāng)前研究的熱點. 研究人員已通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析對多種植物的三萜皂苷合成途徑進(jìn)行了初步探究, 如甘草[9]、人參[10]、羅漢果[11]、崗梅(Ilex asprella)[12]、刺五加(Eleutherococcus senticosus)[13]、桔梗[14]、毛冬青(Ilex pubescens)[15]、皂莢(Gleditsia sinensis)[16]和細(xì)風(fēng)輪菜(Clinopodium gracile)[17]等, 這些研究豐富了三萜皂苷生物合成關(guān)鍵元件的基因庫資源. Zhang等人[18]采用靶向代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)關(guān)聯(lián)分析對遠(yuǎn)志(Polygala tenuifolia)中的三萜皂苷生物合成相關(guān)基因進(jìn)行了初步篩選. Zhan等人[19]以鵝掌草(Anemone flaccida)為材料, 對其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)分析, 發(fā)現(xiàn)了與三萜皂苷生物合成相關(guān)的126個CYP450s(cytochrome P450-dependent monooxygenases)和32個UGTs(uridine diphosphate (UDP)-glucosyltransferases)基因. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所黃三文課題組[20]開展了黃瓜(Cucumis sativus)全基因組關(guān)聯(lián)分析, 發(fā)現(xiàn)了調(diào)控葫蘆素(cucurbitacin)合成途徑的轉(zhuǎn)錄因子(Bl, Bt)和相關(guān)的基因簇. Yan等人[21]對美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)數(shù)據(jù)庫中的9個人參屬EST(Expressed Sequence Tag)文庫數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝和數(shù)據(jù)分析, 篩選出16條UGTs序列進(jìn)行實驗驗證, 獲得了催化人參皂苷合成的第一個糖基轉(zhuǎn)移酶UGTPg1. 多組學(xué)、大數(shù)據(jù)及合成生物學(xué)的聯(lián)合使用為三萜皂苷代謝途徑的解析提供了新的突破口(圖1), 整合基因共表達(dá)分析、基因簇鑒定等方法鑒定三萜皂苷生物合成結(jié)構(gòu)基因、轉(zhuǎn)錄因子等, 同時利用酵母表達(dá)系統(tǒng)和高效的煙草瞬時表達(dá)體系等進(jìn)行功能分析[22]. 新途徑和新基因的發(fā)掘不僅有助于三萜皂苷在底盤植物或微生物中高效合成, 還能為分子設(shè)計育種等方面的研究奠定基礎(chǔ).

2 植物三萜皂苷生物合成途徑

2.1 三萜皂苷生物合成途徑

植物中的三萜均來自異戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate, IPP, C5)和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate, DMAPP, C5). IPP和DMAPP可以由兩條不同的途徑合成: 細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸(mevalonate, MVA)途徑和質(zhì)體中的2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸(2-C-methl-D-erythritol-4-phospate, MEP)途徑. MVA途徑以乙酰輔酶A(acetyl-CoA)為起始底物, 經(jīng)過六步縮合反應(yīng)生成IPP; MEP途徑則是以丙酮酸和甘油醛3-磷酸為起始底物, 經(jīng)過七步反應(yīng)合成IPP[5](圖2B). 其中, MVA途徑在三萜皂苷的生物合成中起到主導(dǎo)作用[1,3,5,23]. IPP和DMAPP在香葉基焦磷酸合成酶(geranylpyrophosphate synthetase, GPS)的作用下經(jīng)過縮合生成香葉基焦磷酸(geranylpyrophosphate, GPP, C10); GPP在法呢基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthetase, FPS)的催化下再加入第二個IPP單元生成法呢基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate, FPP, C15); 然后兩個FPP經(jīng)鯊烯合成酶(squalene synthase, SS)縮合形成角鯊烯(squalene, C30), 隨后在鯊烯氧化酶(squalene epoxidase)的作用下環(huán)氧化生成2,3-氧化鯊烯(2,3-oxidosqualene, C30)[5](圖2B). 2,3-氧化鯊烯經(jīng)環(huán)化、羥基化、糖基化等結(jié)構(gòu)修飾可以合成各種三萜皂苷, 介導(dǎo)這些反應(yīng)的酶有氧化鯊烯環(huán)化酶(OSCs)、細(xì)胞色素P450(CYP450s)和糖基轉(zhuǎn)移酶(UGTs)等(圖2A).

2.2 三萜皂苷生物合成中的關(guān)鍵酶

植物三萜皂苷種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜, 雖然它們有著共同的前體合成途徑, 但后修飾具有高度特異性和多樣性, 而且相關(guān)元件的編碼基因分布在整個基因組中, 以網(wǎng)狀途徑作用產(chǎn)生化合物陣列而非單一化合物, 這大大增加了解析三萜皂苷生物合成途徑的難度[1,3]. 植物中三萜皂苷的積累具有器官和組織特異性, 而且生物或非生物脅迫均可誘導(dǎo)植物三萜皂苷的合成. 三萜皂苷生物合成途徑包含了20余步連續(xù)的酶促反應(yīng), 其中從乙酰輔酶A到2,3-氧化鯊烯的上、中游代謝途徑已研究得比較清晰(圖2B), 該過程中研究得比較多的酶有3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR, EC1.1.1.34)、法呢基焦磷酸合酶(FPS, EC2.5.1.1/EC2.5.1.10)、鯊烯合成酶(SS, EC2.5.1.21)、鯊烯環(huán)氧酶(SE, EC1.14.99.7), 這些酶在植物中均以基因家族的形式存在. HMGR是植物MVA途徑的第一個限速酶[24]; FPS, SS和SE均處在三萜皂苷合成途徑的分支點上[25]. 目前, 僅有少數(shù)幾種參與三萜皂苷生物合成的HMGR, FPS, SS和SE基因被克隆和鑒定(表1).

Overview of HMGR, FPS, SS, and SE related to triterpenoid saponin biosynthesis reported in literaturesa)

關(guān)鍵酶	基因	GenBank登記號	植物來源	功能分析方法	參考文獻(xiàn)
HMGR	PgHMGR1	KM386694	人參	擬南芥突變體/人參(超表達(dá))	[26]
	PnHMGR	KJ578757	三七	三七細(xì)胞株系(超表達(dá))	[27]
	HMGR	JN377411	靈芝	靈芝(超表達(dá))	[28]
FPS	PgFPS	DQ087959	人參	大腸桿菌/積雪草/人參毛狀根(超表達(dá))	[29]
SS	PgSS1	AB115496	人參	刺五加合子胚愈傷組織	[30]
	GuSQS1	AM182329	甘草	甘草毛狀根	[31]
	PnSS	KC953033	三七	三七細(xì)胞株系(超表達(dá))	[27]
SE	NSSQE1	FJ232947	黑種草	酵母	[32]
	PgSQE1	AB122078	人參	人參(RNAi)	[33]
	CpSE2	–	西葫蘆	酵母/煙草/西葫蘆毛狀根	[34]

然而, 三萜皂苷生物合成下游代謝通路從2,3-氧化鯊烯到最后的三萜皂苷形成在不同植物中都有各自的規(guī)律(圖2A), 接下來本文將對后修飾過程中涉及的OSCs, CYP450s和UGTs這三大酶類進(jìn)行具體闡述.

(1) 氧化鯊烯環(huán)化酶.

氧化鯊烯環(huán)化酶(oxidosqualene cyclase, OSCs, EC5.4.99.x)是三萜皂苷下游合成階段的第一個限速酶, 也是三萜皂苷和甾醇生物合成途徑的分支點, 引導(dǎo)2,3-氧化鯊烯經(jīng)質(zhì)子化、環(huán)化、重排和去質(zhì)子化等完成環(huán)化過程生成三萜骨架[7]. 該酶形成了一個超基因家族, 家族成員氨基酸同源性較高, 含有DDTAEA序列(參與底物結(jié)合)和QW特征序列(與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性相關(guān))這兩個高度保守序列[35]. 理論上, 2,3-氧化鯊烯環(huán)化能形成100余種三萜骨架, 其結(jié)構(gòu)多樣性可能與相關(guān)酶的靈活多變核心部位有關(guān), OSC上一個氨基酸序列的改變都可能導(dǎo)致產(chǎn)物發(fā)生改變[7,36~38]. 然而, 迄今發(fā)現(xiàn)的OSCs產(chǎn)物僅有數(shù)十種. 在不同OSCs的作用下, 2,3-氧化鯊烯通過“椅-船-椅”式構(gòu)象變化, 可以轉(zhuǎn)化為protosteryl陽離子, 導(dǎo)致羊毛甾醇(lanosterol)、環(huán)阿屯醇(cycloartenol)、葫蘆二烯醇(cucurbitadienol)、帕克醇(parkeol)等物質(zhì)的形成(圖2A), 這些物質(zhì)又可以進(jìn)一步衍生為植物甾醇、甾體糖苷生物堿、甾體皂苷等; 然而, 羊毛甾醇、環(huán)阿屯醇、葫蘆二烯醇等物質(zhì)在植物中也可以作為三萜的前體[38,39], 在相應(yīng)酶的催化作用下分別衍生成羊毛脂烷型(lanostane)、環(huán)阿屯烷型(cycloartane)和葫蘆烷型(cucurbitane)四環(huán)三萜皂苷, 如靈芝酸C(ganoderic acid C)、黃芪苷IV(asteagalosid IV)、羅漢果苷IE(mogroside IE)等. 2,3-氧化鯊烯通過“椅-椅-椅”式構(gòu)象變化, 則導(dǎo)致了各種三萜皂苷苷元的形成, 該過程中的第一個中間產(chǎn)物是dammarenyl陽離子, dammarenyl陽離子可以直接生成達(dá)瑪烯二醇(dammarenediol-II); 同時, dammarenyl陽離子可以進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化為tirucallanyl陽離子(生成甘遂烷型皂苷元, tirucallane)或baccharenyl陽離子; baccharenyl陽離子又能被轉(zhuǎn)化為五環(huán)的lupanyl陽離子, 從而形成羽扇豆醇(lupeol); lupanyl陽離子的五元環(huán)E環(huán)重新打開、擴(kuò)展成六元環(huán)的過程中, 產(chǎn)生了中間環(huán)化產(chǎn)物germanicyl陽離子, 該陽離子能進(jìn)一步生成oleanyl陽離子(生成β-amyrin)和ursanyl陽離子(生成α-amyrin)(圖2A)[3,7]. 介導(dǎo)這些反應(yīng)的酶主要有達(dá)瑪烯二醇合成酶(dammarenediol-II synthase, DS)、羽扇豆醇合成酶(lupeol synthase, LuS)、α-香樹素合成酶(α-amyrin synthase, αAS)和β-香樹素合成酶(β-amyrin synthase, βAS)等, 分別催化2,3-氧化鯊烯形成達(dá)瑪烷型、甘遂烷型等四環(huán)三萜骨架和齊墩果烷型、烏蘇烷型(ursane)、羽扇豆烷型(lupine)等五環(huán)三萜類骨架, 這些三萜骨架經(jīng)過進(jìn)一步修飾可以生成人參皂苷Rh2(ginsenoside Rh2)、flindissone、甘草甜素(glycyrrhinzin)、28-葡萄糖基-積雪草酸(28-Glc-asiatic acid)、樺木酸(betulinic acid)等三萜皂苷元或皂苷. 此外, Xue等人[40]在秈稻(Oryza sativa?Japonica)中發(fā)現(xiàn)了一種新的多功能OsOSC7(GenBank accession number: ABG22399), 該酶可以使2,3-氧化鯊烯通過“椅-半椅-椅”式構(gòu)象變化轉(zhuǎn)化為一種新的陽離子orysatinyl, 然后進(jìn)一步生成一種新的五環(huán)三萜秈稻醇(orysatinol)(圖2A).

研究人員已經(jīng)從多種植物中克隆得到85條與三萜皂苷生物合成相關(guān)的OSCs基因, 并且在酵母、同源或異源植物宿主中進(jìn)行了功能分析(表2). 進(jìn)化樹分析結(jié)果表明, “椅-半椅-椅”式構(gòu)象變化在系統(tǒng)發(fā)育樹上介于“椅-船-椅”式構(gòu)象變化和“椅-椅-椅”式構(gòu)象變化之間, 常見的不同功能的OSCs(如CS, LuS, DS, βAS和αAS等)分別聚集在發(fā)育樹的不同分枝上(圖3), 可見具有相同功能的OSC序列相似性較高.

Table 2??Overview of OSCs related to triterpenoid saponin biosynthesis reported in literaturesa)

類別	基因		GenBank登記號		植物來源		產(chǎn)物		功能分析方法		參考文獻(xiàn)
DS	PNA		AB265170		人參		dammarenediol-II		酵母		[41]
	DDS		AB122080		人參		dammarenediol-II		酵母/人參(RNAi)		[42]
	CaDDS		AY520818		積雪草		dammarenediol-II		酵母		[43]
	PgDDS		AB122080		人參		dammarenediol-II		煙草		[44]
	PnDS		KC422652		三七		dammarenediol-II		酵母		[45]
	PqDS		KC316048		西洋參		dammarenediol-II		酵母		[46]
LuS	OeOEW		AB025343		油橄欖		lupeol		酵母		[47]
	ToTRW		AB025345		蒲公英		lupeol		酵母		[47]
	BPW		AB055511		白樺		lupeol		酵母		[48]
	GgLUS1		AB116228		光果甘草		lupeol		酵母		[49]
	OSC3		AB181245		百脈根		lupeol		酵母		[50]
	RcLUS		DQ268869		蓖麻		lupeol		酵母		[51]
	BgLUS		AB289586		木欖		lupeol		酵母		[52]
	WsOCS/LS		JQ728552		南非醉茄		lupeol		酵母		[53]
	LUP2		KP784688		歐洲山芥		lupeol		酵母/煙草		[54]
	LsOSC1		MG708182		大花紫薇		lupeol		酵母/煙草		[55]
	TaOSC4		MK547514		阿江欖仁		lupeol		酵母		[56]
	ItOSC6		–		鳶尾		lupeol		酵母		[57]
αAS	PSM		AB034803		豌豆		α-amyrin/β-amyrin		酵母		[58]
	IaAS3079		–		崗梅		α-amyrin/β-amyrin		酵母		[59,60]
	IaAS481		–		崗梅		α-amyrin/β-amyrin		酵母		[59,60]
	BvLUP5G		KP784690		歐洲山芥		α-amyrin/β-amyrin		酵母/煙草		[54]
	LsOSC2		MG708183		大花紫薇		α-amyrin/β-amyrin		酵母/煙草		[55]
	TaOSC2		MK547512		阿江欖仁		α-amyrin/β-amyrin		酵母		[56]
	CrAS		JN991165		長春花		α-amyrin/β-amyrin		酵母		[61]
	EjAS		JX173279		枇杷		α-amyrin/β-amyrin		酵母		[62]
	ObAS2		JQ809437		羅勒		α-amyrin/β-amyrin		酵母		[63]
	OSC9		LC485316		百脈根		α-amyrin		酵母		[64]
	ItOSC2		–		鳶尾		α-amyrin/β-amyrin/δ-amyrin		酵母		[57]
βAS	PNY1		AB009030		人參		β-amyrin		酵母		[65]
	PNY2		AB014057		人參		β-amyrin		酵母		[65]
	PSY		AB034802		豌豆		β-amyrin		酵母		[58]
	GgbAS1		AB037203		光果甘草		β-amyrin		酵母		[66]
	AsbAS1		AJ311789		燕麥		β-amyrin		酵母		[67]
	BPY		AB055512		白樺		β-amyrin		酵母		[48]
	MtAMY1		AF78453		蒺藜苜蓿		β-amyrin		酵母		[68]
	EtAS		AB206469		綠玉樹		β-amyrin		酵母		[69]
	LjAMY1/cOSC1		AB181244		百脈根		β-amyrin		酵母		[50]
βAS	BgbAS		AB289585		木欖		β-amyrin		酵母		[52]
	VhBS		DQ915167		麥藍(lán)菜		β-amyrin		酵母		[70]
	NsbAS1		FJ013228		黑種草		β-amyrin		酵母		[71]
	AtBAS		AB374428		擬南芥		β-amyrin		酵母		[72]
	β-AS		HM219225		遼東楤木		β-amyrin		大腸桿菌/酵母		[73]
	SlTTS1		HQ266579		番茄		β-amyrin		酵母/番茄(超表達(dá))		[74]
	ObAS1		KF636411		羅勒		β-amyrin		酵母		[63]
	MlbAS		KF425519		非洲灌木		β-amyrin		酵母/非洲灌木(RNAi)		[75]
	KsBAS		KT150523		刺楸		β-amyrin		酵母		[76]
	EsBAS		KX378998		刺五加		β-amyrin		酵母/煙草		[77]
	LsOSC3		MG708184		大花紫薇		β-amyrin		酵母/煙草		[55]
	LsOSC4		MG708185		大花紫薇		β-amyrin		酵母/煙草		[55]
	TaOSC1		MK547511		阿江欖仁		β-amyrin		酵母		[56]
	CqbAS1		KX343074		藜麥		β-amyrin		酵母		[78]
CS	CPQ		AB116238		西葫蘆		cucurbitadienol		酵母		[79]
	CsBi/CsCPQ		KM655855		黃瓜		cucurbitadienol		酵母		[20]
	CcCDS2		KM821405		藥西瓜		cucurbitadienol		酵母		[80]
	SgCBQ		HQ128567		羅漢果		cucurbitadienol		酵母		[81]
	CmBi/CmCPQ		XM_008461716		香瓜		cucurbitadienol		酵母		[82]
多功能OSC	BvLUP5P		KP784689		歐洲山芥		α-amyrin/β-amyrin/lupeol		酵母/煙草		[54]
	KcMS		AB257507		秋茄		α-amyrin/β-amyrin/lupeol		酵母		[83]
	MdOSC1		FJ032006		蘋果		α-amyrin/β-amyrin/lupeol		酵母		[62,84,85]
	MdOSC3		FJ032008		蘋果		α-amyrin/β-amyrin/lupeol		酵母/煙草		[84,85]
	BfOSC1		LC464978		紫荊		α-amyrin/β-amyrin/lupeol		酵母/煙草		[86]
	AtLUP2		NM_106545		擬南芥		tirucalla-7,24-dien-3β-ol/α-amyrin/β-amyrin/lupeol/taraxasterol/ψ-taraxasterol/bauerenol		酵母		[87]
	CsOSC2		AB058508		閉鞘姜		β-amyrin/lupeol/germanicol		酵母		[88]
	LjAMY2		AF478455		百脈根		lupeol/β-amyrin/20-hydroxylupeol		酵母/煙草/百脈根(毛狀根)		[89]
	RsM1		AB263203		木欖		germanicol/β-amyrin/lupeol		酵母		[52]
	RsM2		AB263204		木欖		taraxerol/β-amyrin/lupeol		酵母		[52]
	MdOSC4		KT383435		蘋果		β-amyrin/lupeol/germanicol		酵母/煙草		[84]
	MdOSC5		KT383436		蘋果		β-amyrin/lupeol		酵母/煙草		[84]
	SlTTS2		HQ266580		番茄		α-amyrin/β-amyrin/taraxasterol/δ-amyrin		酵母/番茄(超表達(dá))		[74]
	BfOSC2		LC464979		紫荊		β-amyrin/lupeol/germanicol		酵母/煙草		[86]
	AtBARS1		NM_117625		擬南芥		baruol/β-amyrin		酵母		[90]
	AtCAMS1		NM_148667		擬南芥		β-amyrin/camelliol C/achilleol A		酵母		[91]
	AtLUP1		U49919		擬南芥		β-amyrin/lupeol		酵母		[92]
多功能OSC	AtMRN1		NM_123624		擬南芥		marneral/marnerol/camelliol C/achilleol A/δ8-polypodatetraenol		酵母		[93]
	AtTHAS1		NM_124175		擬南芥		thalianol, thalianol-21,22-epoxide		酵母		[94]
	AtPEN1		NM_117622		擬南芥		arabidiol, arabidiol-20,21-epoxide		酵母		[93]
	OsOSC6		KC416147		水稻		α-amyrin/β-amyrin		酵母/水稻		[95]
	OsOSC7		ABG22399		水稻		orysatinol/orysaspirol		酵母		[40]
	OsPS/OsOSC7		AK066327		水稻		parkeol		酵母		[96]
	OsOSC8		AK070534		水稻		achilleol B/tirucalla-7,24-dien-3β-ol/α-amyrin/β-amyrin/ψ-taraxasterol/butyrospermol/dammara-20,24-dien-3β-ol		酵母		[96,97]
其他	OsOSC10		–		水稻		friedelin		酵母		[97]
	OsIAS/OsOSC11		AK067451		水稻		isoarborinol		酵母/擬南芥(超表達(dá))		[39]
	OsOSC12/OsPTS1		–		水稻		poaceatapetol		酵母/水稻		[98]
	AtLAS1		NM_114382		擬南芥		lanosterol		酵母		[99]

(2) 細(xì)胞色素P450.

細(xì)胞色素P450依賴性單加氧酶(CYP450s, EC1.14.x.x)是三萜皂苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶, 催化三萜骨架進(jìn)行羥基化、羧基化、醛基化、酮基化和脫氫脫水等結(jié)構(gòu)修飾, 形成三萜皂苷的中間體[1,3,100]. 典型的CYP450s具有A、B、C、D四個特征性結(jié)構(gòu)域, 其中結(jié)構(gòu)域A上的(A/G)GX(D/E)T(T/S)序列是底物和氧分子連接的部位, 結(jié)構(gòu)域D上的PFG(A/S/V)GRRXC(P/A/V)G序列是鐵血紅素通過共價鍵連接的部位.

CYP450s約占植物基因組蛋白編碼基因的1%, 是參與植物代謝的酶中最大的家族[101]. 根據(jù)氨基酸序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)準(zhǔn), 將同源性>40%和>55%的CYP450s分別歸為同一家族和亞家族. CYP450s的命名規(guī)則為: CYP及其后面的數(shù)字、字母分別表示細(xì)胞色素P450、家族、亞家族和同工酶, v1、v2表示等位基因, P代表假基因. 已知植物中有127個CYP450家族, 其中陸生植物CYP450s被進(jìn)一步劃分為11個家系[101], 參與植物三萜皂苷生物合成的CYP450s主要來自CYP51, CYP71, CYP72和CYP85家系[102]. CYP85家系中的CYP716家族酶被認(rèn)為是雙子葉植物三萜生物合成多樣性的主要貢獻(xiàn)者, 其亞家族CYP716A/-C/-E/-Y成員主要參與雙子葉植物中五環(huán)三萜骨架的氧化; 而來自CYP51家系中的CYP51H亞家族負(fù)責(zé)單子葉植物中五環(huán)三萜骨架的修飾[101,103,104]. CYP71家系中的CYP93E、CYP72家系中的CYP72A和CYP85家系中的CYP88D亞家族成員與豆科植物中三萜骨架的氧化密切相關(guān)[105]. 此外, CYP71家系(成員: CYP705A, CYP71A, CYP71D, CYP81Q)和CYP85家系(成員: CYP87D, CYP88L, CYP708A, CYP716U, CYP716S)也參與了三萜皂苷的生物合成[104].

CYP450s數(shù)量龐大、底物特異性強(qiáng)、序列相似度低, 而且表達(dá)的產(chǎn)物物理性質(zhì)十分相似難以分開, 這大大加深了解析其生物轉(zhuǎn)化步驟的難度[106]. 目前, 僅有73個參與三萜皂苷生物合成的CYP450s被成功鑒定(表3). 通過對這些CYP450s基因的系統(tǒng)發(fā)育分析, 發(fā)現(xiàn)不同家系、家族的CYP450s在發(fā)育樹上被明顯的區(qū)分(圖4), 不同家系中的CYP450s多數(shù)具有相似功能. 例如, 在這73個CYP450s中, 大約有30個CYP716A家族成員具有C-28氧化酶活性, 它們中大多數(shù)催化α-amyrin/β-amyrin/lupeol骨架C-28位連續(xù)三步氧化形成羥基、醛和羧基[106,118,120,124]. 而CYP716E和CYP716S家族成員分別催化三萜C-6、C-2α羥基化, CYP93E家族主要在C-24位催化三萜氧化. 此外, CYP450s還具有催化三萜骨架C-3, C-11, C-12, C-16, C-19, C-20, C-21, C-22, C-23, C-25, C-30等位置氧化的作用.

Table 3??Overview of CYP450s related to triterpenoid saponin biosynthesis reported in literaturesa)

編號	基因	GenBank登錄號	植物來源	底物	反應(yīng)	產(chǎn)物	功能分析方法	參考文獻(xiàn)
1	CYP51H10	DQ680852	燕麥	β-amyrin	C12,C13β環(huán)氧化/C16β羥基化	12,13β-epoxy-16β-hydroxy-β-amyrin	酵母	[107]
2	CYP71D353	KF460438	百脈根	dihydro-lupeol/20-hydroxy-lupeol	C-20羥基化/C-28氧化	20-hydroxy-lupeol/20-hydroxy-betulinic acid	煙草/百脈根(毛狀根)	[89]
3	CYP81Q58	KM655862	黃瓜	19-hydroxy-cucurbitadienol	C-25羥基化/雙鍵位移	19,25-dihydroxy cucurbitadienol	酵母/黃瓜	[20]
4	CYP81Q59	–	香瓜	11-carbonyl-20β-hydroxy-cucurbitadienol	C-2β羥基化	11-carbonyl-2β,20β-dihydroxy-cucurbitadienol	酵母	[82]
5	LjCYP93E1	LC414182	百脈根	β-amyrin	C-24羥基化	24-hydroxy-β-amyrin	酵母/Lotus retrotransposon 1 (LORE1)-tagged lines	[64]
6	CYP93E1	AF135485	大豆	β-amyrin/24-hydroxy-β-amyrin/sophoradiol	C-24羥基化/C-24氧化	24-hydroxy-β-amyrin/24-carboxy-β-amyrin/soyasapogenol B	酵母	[108]
7	CYP93E2	DQ335790	蒺藜苜蓿	β-amyrin	C-24羥基化	24-hydroxy-β-amyrin	酵母	[106,108]
8	CYP93E3	AB437320	甘草	β-amyrin/24-hydroxy-β-amyrin	C-24羥基化/C-24氧化	24-hydroxy-β-amyrin/24-carboxy-β-amyrin	酵母	[108,109]
9	CYP93E4	KF906535	花生	β-amyrin/24-hydroxy-β-amyrin	C-24羥基化/C-24氧化	24-hydroxy-β-amyrin/24-carboxy-β-amyrin	酵母	[108]
10	CYP93E5	KF906536	鷹嘴豆	β-amyrin/24-hydroxy-β-amyrin	C-24羥基化/C-24氧化	24-hydroxy-β-amyrin/24-carboxy-β-amyrin	酵母	[108]
11	CYP93E6	KF906537	光果甘草	β-amyrin/24-hydroxy-β-amyrin	C-24羥基化/C-24氧化	24-hydroxy-β-amyrin/24-carboxy-β-amyrin	酵母	[108]
12	CYP93E7	KF906538	小扁豆	β-amyrin	C-24羥基化	24-hydroxy-β-amyrin	酵母	[108]
13	CYP93E8	KF906539	豌豆	β-amyrin/24-hydroxy-β-amyrin	C-24羥基化/C-24氧化	24-hydroxy-β-amyrin/24-carboxy-β-amyrin	酵母	[108]
14	CYP93E9	KF906540	菜豆	β-amyrin/24-hydroxy-β-amyrin	C-24羥基化/C-24氧化	24-hydroxy-β-amyrin/24-carboxy-β-amyrin	酵母	[108]
15	CYP72A67	DQ335780	蒺藜苜蓿	oleanolic acid/hederagenin/ gypsogenic acid/gypsogenin	C-2β羥基化	2β-hydroxy-oleanolic acid/bayogenin/medicagenic acid/2β, 3β-dihydroxyolean-12-en-23-oxo-28-oic acid	酵母/蒺藜苜蓿(突變株系)	[110]
16	CYP72A61v2	AB558145	蒺藜苜蓿	24-hydroxy-β-amyrin	C-22β羥基化	soyasapogenol B	酵母	[111]
17	CYP72A69	LC143440	大豆	soyasapogenol B	C-21β羥基化	soyasapogenol A	酵母/大腸桿菌	[112]
18	CYP72A475	MH539812	燕麥	12,13β-epoxy, 16β-hydroxy-β-amyrin	C-21β羥基化	12,13β-Epoxy, 16β,21β-dihydroxy-β-amyrin	煙草	[113]
19	CYP72A63	AB558146	蒺藜苜蓿	β-amyrin	C-30氧化	11-deoxoglycyrrhetinic acid	酵母	[114]
20	CYP72A154	AB558153	甘草	β-amyrin/11-oxo-β-amyrin	C-30氧化	30-hydroxy-β-amyrin/glycyrrhetinic acid	酵母	[114]
21	CYP72A68v2	DQ335782	蒺藜苜蓿	oleanolic acid	C-23氧化	gypsogenic acid	酵母	[111]
22	CYP72A397	KT150517	刺楸	oleanolic acid	C-23羥基化	hederagenin	酵母	[76]
23	CYP72A552	–	歐洲山芥	oleanolic acid	C-23羥基化	hederagenin	酵母/煙草	[115]
24	CYP714E19	KT004520	積雪草	oleanolic acid/ursolic acid	C-23羥基化	hederagenin/23-hydroxy ursolic acid	酵母	[116]
25	CYP716A1	NM_123002	擬南芥	α-amyrin/β-amyrin/lupeol	C-28氧化	ursolic acid/oleanolic acid/betulinic acid	酵母	[117]
26	CYP716A12	DQ335781	蒺藜苜蓿	α-amyrin/β-amyrin/lupeol	C-28氧化	ursolic acid/oleanolic acid/betulinic acid	酵母	[106,118]
27	CYP716A15	AB619802	葡萄	α-amyrin/β-amyrin/lupeol	C-28氧化	ursolic acid/oleanolic acid/ betulinic acid	酵母	[106]
28	CYP716A51	AB706297	百脈根	α-amyrin/β-amyrin/lupeol	C-28氧化	ursolic acid/oleanolic acid/betulinic acid	酵母/百脈根毛狀根(CRISPR/Cas9)	[64]
29	CYP716A154/CYP716AL1	JN565975	長春花	α-amyrin/β-amyrin/lupeol	C-28氧化	ursolic acid/oleanolic acid/ betulinic acid	酵母	[119]
30	CYP716A175	XM_008392874	蘋果	α-amyrin/β-amyrin/lupeol	C-28氧化	ursolic acid/oleanolic acid/ betulinic acid	酵母	[84]
31	CYP716A265	MG708187	大花紫薇	α-amyrin/β-amyrin/lupeol	C-28氧化	ursolic acid/oleanolic acid/betulinic acid	酵母/煙草	[55]
32	CYP716A266	MG708188	大花紫薇	α-amyrin/β-amyrin/lupeol	C-28氧化	ursolic acid/oleanolic acid/betulinic acid	酵母/煙草	[55]
33	CYP716A2	LC106013	擬南芥	α-amyrin/β-amyrin/lupeol	C-16/C-22α/C-28羥基化	22α-hydroxy-α-amyrin/22α-hydroxy-β-amyrin/16-hydroxy-β-amyrin/betulin	酵母	[117]
34	CYP716A179	LC157867	甘草	α-amyrin/β-amyrin/lupeol	C-28氧化/C-22α 羥基化	ursolic acid/oleanolic acid/betulinic acid	酵母	[120]
35	CYP716A259	LC325360	白骨壤	α-amyrin/β-amyrin/lupeol	C-28氧化	ursolic acid/oleanolic acid/ betulinic acid	酵母	[121]
36	CYP716A140	KU878853	桔梗	β-amyrin/16β-hydroxy-β-amyrin/12,13α-epoxy-β-amyrin	C-28氧化	oleanolic acid/16β-hydroxy-oleanolic acid/12,13α-epoxy-oleanolic acid	酵母	[103]
37	CYP716A14v2	KF309251	黃花蒿	α-amyrin/β-amyrin/δ-amyrin	C-3氧化	α-amyrone/β-amyrone/δ-amyrone	酵母/煙草/黃花蒿(RNAi)	[122]
38	CYP716A44	AK329870	番茄	α-amyrin/β-amyrin	C-28氧化	ursolic acid/oleanolic acid	酵母	[123]
39	CYP716A46	XM_004243858	番茄	α-amyrin/β-amyrin	C-28氧化	ursolic acid/oleanolic acid	酵母	[123]
40	CYP716A83	KU878849	積雪草	α-amyrin/β-amyrin	C-28氧化	ursolic acid/oleanolic acid	酵母	[103]
41	CYP716A86	KU878848	積雪草	α-amyrin/β-amyrin	C-28氧化	ursolic acid/oleanolic acid	酵母	[103]
42	CYP716A252	JQ958967	羅勒	α-amyrin/β-amyrin	C-28氧化	ursolic acid/oleanolic acid	酵母/羅勒(VIGS)	[124]
43	CYP716A253	JQ958968	羅勒	α-amyrin/β-amyrin	C-28氧化	ursolic acid/oleanolic acid	酵母/羅勒?(VIGS)	[124]
44	CYP716A80	KP795926	歐洲山芥	β-amyrin/lupeol	C-28氧化	oleanolic acid/betulinic acid	酵母/煙草	[54]
45	CYP716A81	KP795925	歐洲山芥	β-amyrin/lupeol	C-28氧化	oleanolic acid/betulinic acid	酵母/煙草	[54]
46	CYP716A141	LC209200/KU8878855	桔梗	β-amyrin/oleanolic acid	C-28氧化/C-16β羥基化	oleanolic acid/16β-hydroxy-oleanolic acid	酵母	[103,105]
47	CYP716A180	KJ452328	白樺	lupeol	C-28氧化	betulinic acid	酵母	[125]
48	CYP716A17	AB619803	葡萄	β-amyrin	C-28氧化	oleanolic acid	酵母	[106]
49	CYP716A52v2	JX036032	人參	β-amyrin	C-28氧化	oleanolic acid	酵母	[126]
50	CYP716A75	KF318733	非洲灌木	β-amyrin	C-28氧化	oleanolic acid	酵母/非洲灌木/蒺藜苜蓿	[75]
51	CYP716A78	KX343075	藜麥	β-amyrin	C-28氧化	oleanolic acid	酵母	[78]
52	CYP716A79	KX343076	藜麥	β-amyrin	C-28氧化	oleanolic acid	酵母	[78]
53	CYP716A94	KT150521	刺楸	β-amyrin	C-28氧化	oleanolic acid	酵母	[76]
54	CYP716A110	KU878864	洛杉磯耬斗菜	β-amyrin	C-28氧化	oleanolic acid	酵母	[103]
55	CYP716A140v2	LC209199	桔梗	β-amyrin	C-28氧化	oleanolic acid	酵母	[105]
56	CYP716A244	KX354739	刺五加	β-amyrin	C-28氧化	oleanolic acid	酵母/煙草	[77]
57	CYP716A254	–	鵝掌草	β-amyrin	C-28氧化	oleanolic acid	酵母	[127]
58	CYP716A111	KY047600	洛杉磯耬斗菜	β-amyrin	C-16β羥基化	16β-hydroxy-β-amyrin	酵母	[103]
59	CYP716C11	KU878852	積雪草	ursolic acid/oleanolic acid/6β-hydroxy-oleanolic acid	C-2α羥基化	corosolic acid /maslinic acid/6β-hydroxy-maslinic acid	酵母	[103]
60	CYP716C53	LC325362	白骨壤	oleanolic acid/ursolic acid	C-2α羥基化	maslinic acid/corosolic acid	酵母	[121]
61	CYP716C55	MG708191	大花紫薇	ursolic acid/oleanolic acid	C-2α羥基化	corosolic acid/maslinic acid	酵母/煙草	[55]
62	CYP716E26	XM_004241773	番茄	α-amyrin/β-amyrin	C-6β羥基化	6β-hydroxy-α-amyrin/daturadiol	酵母	[123]
63	CYP716E41	KU878851	積雪草	ursolic acid/oleanolic acid/maslinic acid	C-6β羥基化	6β-hydroxy-ursolic acid/6β-hydroxy-oleanolic acid/6β-hydroxy-maslinic acid	酵母	[103]
64	CYP716S1v2/CYP716A53v2	JX036031	人參	protopanaxadiol	C-6羥基化	protopanaxatriol	酵母/人參	[119,128]
65	CYP716S5	KU878856	桔梗	β-amyrin/oleanolic acid	C-12,13α環(huán)氧化	12,13α-epoxy-β-amyrin/12,13α-epoxy-oleanolic acid	酵母	[103]
66	CYP716U1/CYP716A47	JN604536	人參	dammarenediol-II	C-12羥基化	protopanaxadiol	酵母/人參	[129]
67	CYP716Y1	KC963423	柴胡	α-amyrin/β-amyrin	C-16α羥基化	16α-hydroxy-α-amyrin/16α-hydroxy-β-amyrin	酵母	[100,103]
68	CYP87D16	KF318735	非洲灌木	β-amyrin	C-16α羥基化	16α-hydroxy-β-amyrin	酵母/非洲灌木/蒺藜苜蓿	[75]
69	CYP87D18	HQ128570	羅漢果	11α-hydroxy-cucurbitadienol/24,25-epoxy-cucurbitadienol/24,25-dihydroxy-cucurbitadienol	C-11羥基化/氧化	11-oxo-cucurbitadienol/11-oxo-24,25-epoxy-cucurbitadienol/mogrol	酵母	[6,130]
70	CYP87D20	KM655862	黃瓜	cucurbitadienol/11-oxo-cucurbitadienol	C-11氧化/C-20β羥基化	11-oxo-cucurbitadienol/11-carbonyl-20β-hydroxy-cucurbitadienol	酵母	[82]
71	CYP88D6	AB433179	甘草	β-amyrin	C-11氧化	11-oxo-β-amyrin	酵母	[109]
72	CYP88L2	NP_001295866	黃瓜	cucurbitadienol	C-19羥基化	19-hydroxy-cucurbitadienol	酵母/黃瓜(RNAi)	[20,82]
73	CYP88A13	MN200611	蒺藜苜蓿	medicagenic acid	C-16α羥基化	zanhic acid	酵母/煙草/蒺藜苜蓿根毛	[131]

(3) 糖基轉(zhuǎn)移酶.

來自糖基轉(zhuǎn)移酶家族1的糖基轉(zhuǎn)移酶(UGTs, EC2.4.1.x), 主要參與植物中天然產(chǎn)物的糖基化, 能將尿嘧啶核苷二磷酸糖上的活性糖基轉(zhuǎn)移到植物中的小分子化合物受體上[132], 與三萜皂苷生物合成相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶屬于這一類. UGTs催化進(jìn)行的三萜糖基化通常被認(rèn)為是三萜皂苷生物合成的最后一步, 是三萜皂苷的多樣性和生物活性形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]. 典型的三萜皂苷含有2~5個糖元, 通常在皂苷元的C-3和/或C-28位置上形成糖鏈; 也存在C-4, C-16, C-20, C-21, C-22和/或C-23位置糖基化的三萜皂苷[1,132]. 常見的糖元有葡萄糖(glucose, Glc)、半乳糖(galactose, Gal)、葡萄糖醛酸(glucoronic acid, GlcA)、鼠李糖(rhamnose, Rha)、木糖(xylose, Xyl)和阿拉伯糖(arabinose, Ara)等五元糖或六元糖. 糖鏈的數(shù)量、組成及其在三萜骨架上的位置, 均影響著三萜皂苷的生物活性、穩(wěn)定性、溶解性和細(xì)胞分隔性[102].

UGTs也以基因家族的形式存在于植物體內(nèi). 根據(jù)氨基酸序列的同源性及其催化特征, UGTs被分為不同的家族(同源性>40%)和亞家族(同源性>60%)[3,133]. 盡管序列同源性不高, 但典型的植物次級代謝性UGTs具有相似的結(jié)構(gòu)域, 擁有PSPG(plant secondary product glycosyltransferase)基序, 該基序是UGTs中與底物結(jié)合的區(qū)域[2,25].

隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展, 越來越多植物的UGT基因序列被公布, 但僅有少數(shù)幾種植物中的UGTs基因被克隆和鑒定, 其中有44個參與了三萜皂苷的生物合成, 總結(jié)在表4中, 這些UGTs主要來自UGT71, 73, 74, 85, 91和94家族[2]. 對這些UGT基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析, 結(jié)果顯示, 不同家族的UGTs處在發(fā)育樹的不同分枝上(圖5), 且具有相似的功能. 例如, UGT73家族的成員多數(shù)具有C-3或C-28位葡萄糖糖基化活性, 而UGT74s和UGT94s常表現(xiàn)出C-3位葡萄糖糖基化作用. 來自不同家族的UGTs可能具有相同的區(qū)域選擇性, 不同的UGTs在不同底物的同一位置可以有相同的功能[2]. 然而, 植物UGTs具有很大程度的底物混亂性, 所以僅通過序列分析和體外生化研究來預(yù)測UGTs的生物功能仍不夠準(zhǔn)確[3,134]. Ribeiro等人[131]還發(fā)現(xiàn), 已鑒定的皂苷生物合成酶基因在蒺藜苜?；蚪M上常常表現(xiàn)為重復(fù)簇狀排列, 該特征在糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因中尤為明顯, 這或許是皂苷代謝進(jìn)化的驅(qū)動力之一.

Table 4??Overview of UGTs related to triterpenoid saponin biosynthesis reported in literaturesa)

編號	基因	GenBank登錄號	植物來源	底物	反應(yīng)	產(chǎn)物	功能分析方法	參考文獻(xiàn)
1	UGT71G1	AY747627	蒺藜苜蓿	medicagenic acid,UDP-Glc	糖基化	medicagenic acid-Glc	大腸桿菌	[134]
2	UGT73AD1	KP195716	積雪草	asiatic acid/madecassic acid, UDP-Glc	C-28β糖基化	28β-Glc-asiatic acid/28β-Glc-madecassic acid	大腸桿菌	[135]
3	UGT73AE1	KJ956788	紅花	glycyrrhetinic acid, UDP-Glc	O/S/N-糖基化	glycyrrhizin	大腸桿菌	[136]
4	UGT73AH1	MF471454	積雪草	asiatic acid, UDP-Glc	C-28糖基化	28-Glc-asiatic acid	大腸桿菌	[137]
5	UGT73AM3	–	黃瓜	cucurbitacin C,UDP-Glc	C-3糖基化	3-O-β-D-Glc- cucurbitacin C	大腸桿菌/黃瓜	[138]
6	UGT73C10	JQ291613	歐洲山芥	β-amyrin/oleanolic acid/betulinic acid/hederagenin/3-Glc-oleanolic acid, UDP-Glc	C-3/C-28糖基化	3-Glc-β-amyrin/3-Glc-oleanolic acid/3-Glc-betulinic acid/28-Glc-betulinic acid/3-Glc-hederagenin/3-Glc-28-Glc-oleanolic acid	大腸桿菌	[139]
7	UGT73C11	JQ291614	歐洲山芥	β-amyrin/oleanolic acid/betulinic acid/hederagenin, UDP-Glc	C-3/C-28糖基化	3-Glc-β-amyrin/3-Glc-oleanolic acid/3-Glc-betulinic acid/3-Glc-hederagenin/28-Glc-betulinic acid	大腸桿菌/煙草	[139,140]
8	UGT73C12	JQ291615	歐洲山芥	β-amyrin/oleanolic acid/betulinic acid/hederagenin/3-Glc-oleanolic acid/3-Glc-hederagenin, UDP-Glc	C-3/C-28糖基化	3-Glc-β-amyrin/3-Glc-oleanolic acid/3-Glc-betulinic acid/28-Glc-betulinic acid/3-Glc-hederagenin/3-Glc-28-Glc-oleanolic acid/3-Glc-28-Glc-hederagenin/3-Glc-28-Glc-betulinic acid	大腸桿菌	[139]
9	UGT73C13	JQ291616	歐洲山芥	β-amyrin/oleanolic acid/betulinic acid/hederagenin/3-Glc-oleanolic acid/3-Glc-hederagenin, UDP-Glc	C-3/C-28糖基化	3-Glc-β-amyrin/3-Glc-oleanolic acid/3-Glc-betulinic acid/28-Glc-betulinic acid/3-Glc-hederagenin/3-Glc-28-Glc-oleanolic acid/3-Glc-28-Glc-hederagenin/3-Glc-28-Glc-betulinic acid	大腸桿菌/煙草	[139]
10	UGT73C22	MF448363	歐洲山芥	oleanolic acid/hederagenin, UDP-Glc	C-3/C-28糖基化	3-Glc-oleanolic acid/3-Glc-28-Glc-oleanolic acid/3-Glc-28-Glc-hederagenin/28-Glc-hederagenin/28-Glc-oleanolic acid	大腸桿菌/煙草	[139]
11	UGT73C23	MF448369	歐洲山芥	oleanolic acid/hederagenin, UDP-Glc	C-3/C-28糖基化	3-Glc-oleanolic acid/3-Glc-28-Glc-oleanolic acid/3-Glc-hederagenin/3-Glc-28-Glc-Hederagenin/3-glc-23-glc-hederagenin	大腸桿菌/煙草	[140]
12	UGT73C25	MF448366	歐洲山芥	oleanolic acid/hederagenin, UDP-Glc	C-3/C-23/C-28糖基化	3-Glc-oleanolic acid/3-Glc-28-Glc-oleanolic acid/3-Glc-hederagenin/3-glc-23-glc-hederagenin	大腸桿菌/煙草	[140]
13	UGT73C21	MF448360	歐洲山芥	oleanolic acid/hederagenin, UDP-Glc	C-3糖基化	3-Glc-oleanolic acid/3-Glc-hederagenin	大腸桿菌/煙草	[140]
14	UGT73C26	MF448353	歐洲山芥	oleanolic acid/hederagenin, UDP-Glc	C-3糖基化	3-Glc-oleanolic acid/3-Glc-hederagenin	大腸桿菌/煙草	[140]
15	UGT73C27	MF448357	歐洲山芥	oleanolic acid/hederagenin, UDP-Glc	C-3糖基化	3-Glc-oleanolic acid/3-Glc-hederagenin	大腸桿菌/煙草	[140]
16	UGT73F18	MN200615	蒺藜苜蓿	medicagenic acid	C-3糖基化	3-Glc-medicagenic acid	酵母/煙草	[131]
17	UGT73F19	MN200616	蒺藜苜蓿	medicagenic acid/gypsogenic acid	C-3糖基化	3-Glc-medicagenic acid/3-Glc-gypsogenic acid	酵母/煙草	[131]
18	PjOAGT	MH819287	竹節(jié)參	oleanolic acid,UDP-GlcA	C-3糖基化	oleanolic acid 3-O-glucoronide	大腸桿菌	[141]
19	PzOAGT1	MH819284	姜狀三七	oleanolic acid,UDP-GlcA	C-3糖基化	oleanolic acid 3-O-glucoronide	大腸桿菌	[141]
20	PzOAGT2	MH819285	姜狀三七	oleanolic acid,UDP-GlcA	C-3糖基化	oleanolic acid 3-O-glucoronide	大腸桿菌	[141]
21	PzOAGT3	MH819286	姜狀三七	oleanolic acid,UDP-GlcA	C-3糖基化	oleanolic acid 3-O-glucoronide	大腸桿菌	[141]
22	GuUGAT	KT759000	甘草	glycyrrhetinic acid/3-GlcA-glycyrrhetinic acid, UDP-GlcA	C-3糖基化	3-GlcA-glycyrrhetinic acid/glycyrrhizin	大腸桿菌	[142]
23	UGT73F2	AB628089	大豆	saponin A0-gα,UDP-Glc	C-22糖基化	saponin Ab	大腸桿菌/定點突變分析/轉(zhuǎn)基因互補試驗	[143]
24	UGT73F3	FJ477891	蒺藜苜蓿	hederagenin/soyasapogenol A/soyasapogenol B/bayogenin/medicagenic acid, UDP-Glc	C-28/C-3糖基化	hederagenin-C28-O-Glc/ soyasapogenol A-Glc /soyasapogenol B-Glc/ bayogenin-C28-O-Glc/ medicagenic acid-C28-O-Glc	大腸桿菌/蒺藜苜蓿(基因功能缺失分析)	[144]
25	UGT73F4	AB628091	大豆	saponin A0-αg,UDP-Xyl	C-22糖基化	saponin Aa	大腸桿菌/定點突變分析/轉(zhuǎn)基因互補試驗	[143]
26	UGT73B4	NM_001367432	大豆	soyasapogenol B/soyasaponin I, UDP-Glc/UDP-Gal	C-22糖基化	22-Glc-soyasapogenol B,22-Gal-soyasapogenol B,22-Glc-soyasaponin I, 22-Gal-soyasaponin I	大腸桿菌	[145]
27	UGT73F17	MH049688	甘草	glycyrrhizin, UDP-Glc	C-30/C-29糖基化	licorice-saponin A3	大腸桿菌	[146]
28	UGT73K1	AY747626	蒺藜苜蓿	hederagenin/soyasapogenol B/soyasapogenol E, UDP-Glc	糖基化	hederagenin-Glc,soyasapogenol B-Glc,soyasapogenol E-Glc	大腸桿菌	[134]
29	UGT74AE2	JX898529	人參	protopanaxadiol/ginsenoside compound K, UDP-Glc	C-3糖基化	ginsenoside Rh2/ginsenoside F2	酵母	[147]
30	UGT74M1	DQ915168	麥藍(lán)菜	gypsogenic acid/betulinic acid/hederagenin/gypsogenin/echinocystic acid/16α-hydroxygypsogenic acid/quillaic acid, UDP-Glc	C-28糖基化	28-Glc-gypsogenic acid/28-Glc-betulinic acid/28-Glc-hederagenin/28-Glc-gypsogenin/28-Glc-echinocystic acid/28-Glc-16α-hydroxygypsogenic acid/28-Glc-quillaic acid	大腸桿菌	[70]
31	UGT94Q2	JX898530	人參	ginsenoside Rh2/ginsenoside F2, UDP-Glc	C-3糖基化	ginsenoside Rg3/ginsenoside Rd	酵母/西洋參/人參(RNAi)	[147,148]
32	UGT71A27 /UGTPg1	KM491309	人參	dammarenediol-II/protopanaxadiol/protopanaxatriol/ginsenoside Rh2/ginsenoside Rg3,UDP-Glc	C-20糖基化	20S-O-β-(D-glucosyl)-dammarenediol II(DMG)/ginsenoside compound K/ginsenoside F1/ginsenoside F2/ginsenoside Rd	酵母	[21]
33	UGTPg100	KP795113	人參	protopanaxatriol,UDP-Glc	C-6糖基化	ginsenoside Rh1	酵母	[149]
34	UGTPg101	KP795114	人參	protopanaxatriol/ginsenoside F1,UDP-Glc	C-20/C6糖基化	ginsenoside F1/ginsenoside Rg1	酵母	[149]
35	UGTPg45	KM401918	人參	protopanaxadiol/ginsenoside compound K, UDP-Glc	C-3糖基化	ginsenoside Rh2/ ginsenoside F2	酵母/大腸桿菌	[150]
36	UGTPg29	KM401911	人參	ginsenoside Rh2/ginsenoside F2, UDP-Glc	C-3糖基化	ginsenoside Rg3/ginsenoside Rd	酵母/大腸桿菌	[150]
37	Pq3-O-UGT2 (UGT94)	KR106207	西洋參	ginsenoside Rh2/ginsenoside F2, UDP-Glc	C-3糖基化	ginsenoside Rg3/ginsenoside Rd	酵母/西洋參/人參毛狀根(RNAi)	[148]
38	Pq3-O-UGT1 (UGT74)	KiR028477	西洋參	protopanaxadiol, UDP-Glc	C-3糖基化	ginsenoside Rh2	酵母/西洋參毛狀根(超表達(dá)/RNAi)	[151]
39	UGT73P2/GmSGT2	AB473730	大豆	soyasapogenol B/3-O-glucuronide, UDP-Gal	C-3糖基化	soyasaponin III	大腸桿菌	[152]
40	UGT91H4/GmSGT3	AB473731	大豆	soyasaponin III, UDP-Rha	C-3糖基化	soyasaponin I	大腸桿菌	[152]
41	UGRdGT	–	三七	ginsenoside Rd, UDP-Glc	糖基化	ginsenoside Rb1	體外生物轉(zhuǎn)化	[153]
42	UGT74AC1	HQ259620	羅漢果	mogrol, UDP-Glc	C-3糖基化	mogroside IE	大腸桿菌	[81]
43	UGT720-269-1	–	羅漢果	mogrol/mogroside I-A1, UDP-Glc	C-3/C-24糖基化	mogroside I-A1/mogroside IIE	酵母/大腸桿菌	[6]
44	UGT94-289-3	–	羅漢果	mogroside IIE/mogroside IIIx/mogroside IV-A/siamenoside, UDP-Glc	C-3/C-24糖基化	mogroside IIIx/mogroside IV-A/siamenoside/mogroside V	酵母/大腸桿菌	[6]

3 三萜皂苷生物合成的調(diào)控

植物中, 三萜皂苷的生物合成受基因調(diào)控的影響. 通過增加基因拷貝數(shù)或沉默競爭代謝通路基因, 可人為改變?nèi)粕锖铣赏緩交虻谋磉_(dá), 提高三萜皂苷化合物的含量[8]. 研究表明, 通過HMGR, FPS, SS和SE基因的過表達(dá)或RNAi(RNA interference)可實現(xiàn)人參、三七等植物中三萜皂苷生物合成的調(diào)控[27,33,154,155]. 此外, 茉莉酸衍生物(如茉莉酸甲酯, methyl jasmonate, MeJA)的外源處理能影響植物中三萜皂苷的積累. 在人參、積雪草、三七、西洋參、藜麥等植物中, MeJA處理能提高植物體內(nèi)、離體組織或細(xì)胞內(nèi)FPS, SS, SE, OSCs, CYP450s及UGTs等酶基因的表達(dá)活性, 從而影響其皂苷的積累[2,29,33,42,78,119,129,151,156~158], 但不同酶對MeJA的響應(yīng)存在差異. 三萜皂苷的生物合成除了受相關(guān)酶基因調(diào)控外, 還受到轉(zhuǎn)錄因子和microRNA(miRNA)等在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控. 因此, 下文將對植物三萜皂苷生物合成中已報道的轉(zhuǎn)錄因子和miRNA進(jìn)行總結(jié).

3.1 轉(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors, TFs)是一類DNA結(jié)合蛋白, 可以通過自身或與其他蛋白的相互作用激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄[159]. TFs在植物次生代謝產(chǎn)物生物合成過程中可以同時控制多個關(guān)鍵基因的表達(dá). 目前, 已報道調(diào)控植物三萜生物合成的TFs類型有bHLH(basic helix-loop-helix)、AP2/ERF(APETALA2/ethylene-responsive factor)、bZIP(basic region/leucine zipper motif)、WRKY等四種(圖6). Mertens等人[160]從蒺藜苜蓿中鑒定出兩種同源的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix)家族的MeJA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(bHLH TFs), TSAR1(triterpene saponin biosynthesis activating regulator 1)和TSAR2. 其中, TSAR1可以促進(jìn)非溶血性大豆皂苷的生物合成, 激活bAS,?CYP93E2,?CYP72A61v2等相關(guān)酶基因的表達(dá), TSAR2可促進(jìn)溶血性大豆皂苷的合成, 并激活bAS,?CYP716A12和CYP72A68v2等相關(guān)酶基因的表達(dá). 而后, 該研究團(tuán)隊基于蒺藜苜蓿種子發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 通過基因共表達(dá)分析, 鑒定出另一個轉(zhuǎn)錄因子TSAR3, 該轉(zhuǎn)錄因子可以激活bAS,?CYP716A12,?CYP72A67,?CYP72A68,?CYP88A13和UGT73F3等相關(guān)酶基因的表達(dá), 促進(jìn)蒺藜苜蓿中溶血性皂苷的合成[131]. 甘草中的bHLH3可激活bAS,?CYP93E3和CYP72A566的表達(dá), 且系統(tǒng)發(fā)育分析表明, bHLH3與TSAR2(53%)的氨基酸序列相似性高于TSAR1(43%)[161]. Jarvis等人[162]發(fā)現(xiàn)了藜麥中的兩個bHLH轉(zhuǎn)錄因子TSARL1和TSARL2, 它們可以增加藜麥體內(nèi)三萜生物合成途徑中基因的表達(dá). 此外, 研究學(xué)者們也在黃瓜[20]、三七[163]、人參[164]、白樺[165]等植物中發(fā)現(xiàn)了調(diào)控三萜生物合成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子. 近年來, 研究還發(fā)現(xiàn), bHLH轉(zhuǎn)錄因子與植物三萜類化合物生物合成相關(guān)基因簇的表達(dá)調(diào)控有關(guān), 例如, TSAR1和TSAR2參與HMGR1和MKB1(MAKIBISHI1, RING membrane anchor-like E3 ubiquitin ligase)所在基因簇的表達(dá)調(diào)控, 促進(jìn)蒺藜苜蓿三萜皂苷生物合成[160]; 而黃瓜中的兩個組織特異性bHLH轉(zhuǎn)錄因子Bl(bitter leaf)和Bt(bitter fruit)可以對葫蘆素合成相關(guān)基因簇進(jìn)行調(diào)控[20]. 除了bHLH家族外, 也發(fā)現(xiàn)了AP2/ERF, bZIP, WRKY家族的轉(zhuǎn)錄因子參與植物三萜皂苷生物合成調(diào)控的情況, 例如, 三七中的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子ERF1, 在三七皂苷生物合成中起正調(diào)控因子作用[159]; 而北柴胡(Bupleurum chinense)中的bZIP轉(zhuǎn)錄因子bZIP134, 起著負(fù)調(diào)控柴胡皂苷生物合成的作用[166]. 南非醉茄中的WRKY轉(zhuǎn)錄因子WRKY1對其體內(nèi)三萜化合物withanolides的生物合成起著積極的調(diào)控作用[167]. Sun等人[168]報道, 西洋參中的WRKY1可以調(diào)控擬南芥中的FPPS, SQS和SQE等三萜合成途徑基因, 但并未研究其對三萜類代謝產(chǎn)物的影響. 現(xiàn)今, 關(guān)于三萜皂苷生物合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究仍較少, 加強(qiáng)此方面的研究不僅有助于了解植物三萜皂苷代謝途徑的調(diào)控機(jī)制, 還可以將其作為調(diào)控工具應(yīng)用到相關(guān)代謝工程, 助力植物三萜皂苷基礎(chǔ)研究和人工合成的發(fā)展.

3.2 miRNA

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小RNA, 在植物基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[169]. 近年來, 研究發(fā)現(xiàn)miRNA是許多植物中調(diào)節(jié)次級代謝物產(chǎn)生的主要生物因子[170]. 因此, 為了高效獲取植物中的三萜皂苷, 除了確定其合成和代謝途徑的關(guān)鍵酶基因和轉(zhuǎn)錄因子, 研究miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平對關(guān)鍵酶基因和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用也是至關(guān)重要的. 隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展, 越來越多植物的miRNA被預(yù)測出來. Mathiyalagan等人[171]研究表明, miR854e可能靶向調(diào)控高麗參人參皂苷生物合成中的FPS基因, 而miR1439b和miR1439h可能靶向調(diào)控βAS基因. Wei等人[172]預(yù)測三七中的miR5021, miR5163, miR5293和novel_miR_27可能靶向調(diào)控萜類主鏈生物合成途徑中的基因. Fan等人[173]結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對蒼耳(Xanthium strumarium)中miRNA及其靶基因進(jìn)行了鑒定與分析, 結(jié)果表明, miR5255和miR5491分別靶向調(diào)控SE和βAS, 進(jìn)而對萜類生物合成進(jìn)行調(diào)控. 李華云等人[174]、陳艷琳等人[175]分別對長白山人參和甘草中miRNA的靶基因進(jìn)行了預(yù)測和相應(yīng)的生物信息學(xué)分析. Kajal和Singh[176]報道吊蘭(Chlorophytum borivilianum)中的miR9662, miR894, miR172和miR166可能參與了其體內(nèi)三萜皂苷生物合成的調(diào)控. 這些工作為miRNA在三萜皂苷生物合成中的調(diào)控機(jī)制研究提供了數(shù)據(jù)資源, 然而, 三萜皂苷生物合成相關(guān)的miRNA研究仍處于起步階段, 迄今為止報道的相關(guān)miRNA仍較少, 且多數(shù)僅進(jìn)行了功能預(yù)測, 這些miRNA作用的靶基因及其調(diào)控植物三萜皂苷代謝的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究.

4 微生物細(xì)胞工廠中三萜皂苷的合成

合成生物學(xué)是涉及分子生物學(xué)、微生物學(xué)、生物工程、計算科學(xué)以及材料科學(xué)等多個領(lǐng)域的具有巨大潛力的綜合性學(xué)科, 以生命科學(xué)理論為指導(dǎo), 旨在通過參考化合物的生物合成途徑, 人工設(shè)計、構(gòu)建具有某種特定功能或全新的生物系統(tǒng)[177,178]. 目前, 合成生物學(xué)已被廣泛應(yīng)用于藥物生產(chǎn)、疫苗開發(fā)、再生醫(yī)學(xué)等方面[179]. 隨著合成生物學(xué)的發(fā)展和植物三萜皂苷生物合成途徑的不斷解析, 利用合成生物學(xué)理論和技術(shù)生產(chǎn)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、稀有的生物活性三萜皂苷已取得了一定成果.

通過合成生物學(xué)技術(shù)在微生物中設(shè)計代謝途徑和模塊組成的生物元件, 利用微生物的發(fā)酵工程生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物, 已成為現(xiàn)今獲得稀有次生代謝產(chǎn)物的一種最先進(jìn)、最快捷的方式. 與植物相比, 微生物具有生長快、節(jié)約土地、大規(guī)模發(fā)酵等優(yōu)點. 其中, 酵母是最常用微生物, 尤其在三萜皂苷的合成上擁有獨特的優(yōu)勢, 這是由于酵母細(xì)胞膜上可以積累大量的三萜類化合物麥角固醇或合成途徑的中間體. 近年來, 隨著合成生物學(xué)的發(fā)展, 一些三萜皂苷和苷元已在微生物細(xì)胞工廠成功合成(表5). 在微生物細(xì)胞工廠中從頭合成人參皂苷是當(dāng)前研究的熱點, 目前, 已在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中成功合成了三種苷元(原人參二醇, protopanoxadiol, PPD; 原人參三醇, protopanaxatriol, PPT; 齊墩果酸, oleanolic acid, OA)、兩種非天然人參皂苷(compound K, CK; 3β,12β-Di-O-Glc-PPD)和四種天然人參皂苷(Rh2, Rg3, RF1和Rh1). Han等人[129]將人參達(dá)瑪烯二醇合成酶(PgDS)、人參CYP716A47和擬南芥CYP450還原酶1(AtCPR1)基因?qū)脶劸平湍钢泄脖磉_(dá), 首次在微生物中合成了人參皂苷苷元PPD. 隨后, 該研究團(tuán)隊又在酵母工程菌中相繼合成了PPT和OA[119,126], 但是這三種人參皂苷元在酵母中的產(chǎn)量均較低. 為了提高產(chǎn)量, Dai等人[180]通過提高關(guān)鍵基因的表達(dá)活性和進(jìn)行相關(guān)編碼基因密碼子優(yōu)化等措施, 使PPD產(chǎn)量增加了262倍; 在此基礎(chǔ)上, 再通過雙相發(fā)酵工藝優(yōu)化, 最終使PPD產(chǎn)量提高到1.2?g/L.?研究還發(fā)現(xiàn), 把OA, PPD和PPT的功能模塊導(dǎo)入同一底盤細(xì)胞, 可同時生產(chǎn)這三種人參皂苷元, 這便是第一代基于多組分概念的“人參酵母”細(xì)胞工廠[181]. 另外, 相關(guān)研究團(tuán)隊還報道了細(xì)胞工廠生產(chǎn)三萜10?g/L級別的方案, 可以使酵母工程菌生產(chǎn)的達(dá)瑪烯二醇產(chǎn)量高達(dá)15?g/L[188].?中國科學(xué)院上海植物生理生態(tài)研究所與中國科學(xué)院上海藥物研究所合作, 對人參皂苷CK, Rh2, Rg3, RF1和Rh1生物合成途徑中的關(guān)鍵糖基轉(zhuǎn)移酶和P450還原酶PgCPR1進(jìn)行了詳細(xì)研究, 通過酵母細(xì)胞工廠的構(gòu)建和優(yōu)化, 實現(xiàn)了利用單糖發(fā)酵生產(chǎn)這些稀有人參皂苷的工藝[21,149,150]. 此外, 科研工作者也開展了釀酒酵母生產(chǎn)甘草次酸(glycyrrhetinic acid, GA)[184]、柴胡皂苷元[100]和羅漢果苷V[6]等方面的研究. Wang等人[189]將密碼子優(yōu)化的CYP88D6和CYP72A154, 與β-AS和來自擬南芥的細(xì)胞色素P450還原酶(NADPH-cytochrome P450)基因引入釀酒酵母中, 成功合成了GA(14?μg/L);?進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn), 甘草細(xì)胞色素b5(GuCYB5)的引入, 可使GA產(chǎn)量提高8倍; 采用組合發(fā)酵策略, GA產(chǎn)量可提高近630倍, 達(dá)8.78?mg/L;?通過使用不同植物源的細(xì)胞色素P450還原酶和增加Uni25647的拷貝數(shù), 可使GA產(chǎn)量增加到(18.9±2.0)?mg/L[184]. 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所團(tuán)隊還報道了一個涵蓋差異轉(zhuǎn)錄組分析、代謝物分析、候選基因在底盤細(xì)胞中的表征、化合物鑒定和植物組織培養(yǎng)的“即插即用”生物合成途徑快速解析平臺, 并通過該平臺開發(fā)出了生產(chǎn)山楂酸(384?mg/L)和科羅索酸(141?mg/L)的釀酒酵母細(xì)胞 工廠[186,187].

Table 5??Heterologous synthesis of several important triterpenoids

三萜皂苷或中間體	產(chǎn)量	參考文獻(xiàn)
原人參二醇(PPD)	1.2?g/L	[180]
原人參三醇(PPT)	15.9?mg/L	[181]
人參皂苷CK(ginsenoside CK)	1.4?mg/L	[21]
人參皂苷Rg3	1.3?mg/L	[147]
人參皂苷RF1	42.1?mg/L	[149]
人參皂苷Rh1	92.8?mg/L	[149]
人參皂苷Rh2	300?mg/L	[182]
3β,12β-Di-O-Glc-PPD	9.05?mg/L	[183]
甘草次酸(GA)	18.9?mg/L	[184]
齊墩果酸	606.9?mg/L	[185]
山楂酸	384?mg/L	[186,187]
科羅索酸	141?mg/L	[186,187]

雖然三萜皂苷在微生物細(xì)胞工廠中的合成已取得了一定的進(jìn)展, 但仍面臨著許多挑戰(zhàn), 例如, 大多數(shù)三萜皂苷的生物合成途徑尚不清楚, 一些關(guān)鍵酶很難在微生物宿主中表達(dá), 某些三萜皂苷對微生物細(xì)胞具有毒性, 工程細(xì)胞異源合成效率低, 人工智能等自動化技術(shù)使用程度較低等. 針對這些問題, 研究學(xué)者們也陸續(xù)提出了許多解決方案, 比如使用底物混雜酶[182], 將蛋白質(zhì)工程[190]、形態(tài)學(xué)工程[191]等技術(shù)應(yīng)用其中, 進(jìn)行代謝流量動態(tài)調(diào)節(jié)和區(qū)域化設(shè)置[5,100]等. 隨著生物學(xué)技術(shù)和人工智能技術(shù)的發(fā)展, 三萜皂苷的人工合成將迎來新的時代.

5 展望

三萜皂苷是植物中一類重要的次級代謝產(chǎn)物, 在植物和外界環(huán)境的相互作用中起著重要作用, 且具有多種應(yīng)用價值, 與人類的生活和發(fā)展息息相關(guān). 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展, 三萜皂苷生物合成途徑不斷被解析, 關(guān)鍵酶基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、生物工程方面的研究也取得了一定進(jìn)展. 相關(guān)研究主要集中在三萜皂苷生物合成后修飾階段關(guān)鍵酶(OSC, CYP450和UGT)基因的發(fā)掘, 并在微生物(酵母)和/或異源宿主(如模式植物: 煙草)中進(jìn)行功能分析, 但其中大多數(shù)在植物體內(nèi)的功能仍處于未知狀態(tài); 而且關(guān)鍵酶的具體催化過程、結(jié)構(gòu)修飾和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制(轉(zhuǎn)錄因子、miRNA等)方面的研究依然較少, 人們對三萜皂苷生物合成途徑的認(rèn)識仍不夠系統(tǒng)和全面; 再加上三萜皂苷種類繁多, 在植物中的生物合成途徑冗長而復(fù)雜, 使得三萜皂苷生物合成途徑全面解析、植物體內(nèi)三萜皂苷代謝調(diào)控和采用合成生物學(xué)及體外培養(yǎng)等方法來生產(chǎn)三萜皂苷仍存在困難.

隨著分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)和合成生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展及其在各個領(lǐng)域的應(yīng)用和滲透, 以大數(shù)據(jù)為驅(qū)動, 開展多層次的研究, 將加速三萜皂苷的基礎(chǔ)研究和相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展. 未來, 或可加強(qiáng)以下四方面研究.

(1) 利用多組學(xué)和大數(shù)據(jù)進(jìn)行三萜皂苷生物合成途徑功能基因的發(fā)掘和代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究, 構(gòu)建從基因到代謝的調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 并將功能基因組學(xué)技術(shù)(如VIGS, RNAi和CRISPR/Cas9等)應(yīng)用到非模式植物中, 探討其生化功能, 明確三萜皂苷合成的調(diào)控機(jī)制, 進(jìn)一步解析植物三萜皂苷的生物合成途徑.

(2) 進(jìn)行三萜皂苷在植物體內(nèi)合成部位及其轉(zhuǎn)運機(jī)制研究. 研究三萜皂苷合成部位, 并構(gòu)建相關(guān)元件特異性表達(dá)的啟動子, 使其只在合成部位表達(dá), 實現(xiàn)三萜皂苷的定向合成; 或通過沉默競爭途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá), 來增強(qiáng)三萜皂苷的生物合成; 開展三萜皂苷相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白及其轉(zhuǎn)運機(jī)制的研究.

(3) 開展三萜皂苷合成生物學(xué)研究. 將基因工程技術(shù)和生物工程技術(shù)結(jié)合, 在微生物中構(gòu)建三萜皂苷代謝途徑, 通過微生物生產(chǎn)大量有價值的三萜皂苷. 可以通過提高前體物質(zhì)的供給、增加相關(guān)酶基因的效率, 或抑制競爭代謝途徑, 改善培養(yǎng)條件等來提高目標(biāo)代謝物的生產(chǎn). 同時, 加強(qiáng)人工智能等自動化技術(shù)在微生物細(xì)胞工廠方面的應(yīng)用.

(4) 通過體外組織培養(yǎng)來生產(chǎn)三萜皂苷. 采用植物組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、體細(xì)胞胚胎發(fā)生和根培養(yǎng)等方法來生產(chǎn)三萜皂苷, 并將細(xì)胞工程技術(shù)、基因工程等技術(shù)應(yīng)用其中, 獲得高效合成三萜皂苷、遺傳性質(zhì)穩(wěn)定、培養(yǎng)特性優(yōu)良的基因工程植物細(xì)胞系, 以實現(xiàn)三萜皂苷的大規(guī)模生產(chǎn).