? ? ? ? 納米抗體（nanobodies，Nbs）是由比利時(shí)科學(xué)家Hamers等人在駱駝血液內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的一種新型抗體，與傳統(tǒng)抗體相比，這種抗體不存在輕鏈，只有重鏈抗體（HcAb）和兩個(gè)常規(guī)的CH2和CH3區(qū)組成，分子量只有15 KDa左右，被稱為納米抗體。HcAb 的特異性僅依賴于稱為 VHH 的重可變域。VHH 的重組產(chǎn)物被稱為單域抗體 (sdAb) 或納米抗體的片段[1]。

一、納米抗體相對(duì)傳統(tǒng)抗體的優(yōu)勢(shì)：

（1）和靶點(diǎn)結(jié)合特異性更強(qiáng)；

（2）更高的組織穿透力；

（3）更高的穩(wěn)定性如耐高溫；

（4）適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)；

（5）更容易改造和優(yōu)化；

（6）更容易人源化；

二、納米抗體的制備方法

? ? ? ? ? 傳統(tǒng)單克隆抗體通常用雜交瘤的方法進(jìn)行制備，而納米抗體則多通過(guò)噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行制備。

? ? ? ? 噬菌體展示技術(shù)（即：納米抗體技術(shù)）是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入M13噬菌體的P3蛋白基因序列的適當(dāng)位置，以達(dá)到外源基因隨噬菌體外殼蛋白的表達(dá)而在噬菌體表面進(jìn)行展示的目的。噬菌體展示的優(yōu)勢(shì)在于其展示納米抗體文庫(kù)中變異抗體基因的多樣性，各個(gè)重組噬菌體（常用噬菌體為M13噬菌體）表面展示出不同的抗原結(jié)合域，相較于傳統(tǒng)雜交瘤方法，噬菌體展示技術(shù)在抗體基因展示與篩選層面則具有非常突出的效率優(yōu)勢(shì)（如雜交瘤融合效率一般<0.4%，即1000次融合細(xì)胞中，大概4個(gè)融合子；而噬菌體展示輕松可以獲得108-109個(gè)正確抗體序列）。

三、納米抗體的制備流程

? ? ? 納米抗體的制備流程主要分為羊駝免疫，噬菌體文庫(kù)構(gòu)建，篩選抗體庫(kù)、抗體表達(dá)與功能驗(yàn)證四個(gè)步驟[2]。

? ? ? 為了建立免疫庫(kù)，首先必須給年輕的、健康的美洲駝、單峰駱駝、羊駝等進(jìn)行免疫。通常，在2個(gè)月的時(shí)間跨度內(nèi)，動(dòng)物被注射4-8次目標(biāo)抗原和佐劑的混合物。一般每次注射約50-200μg免疫原；確切數(shù)量顯然取決于抗原分子量，更取決于其免疫原性和/或毒性。

? ? ? 免疫原類型：使用可溶性、正確折疊的重組蛋白是首選推薦，也有直接DNA免疫。通?；旌隙噙_(dá)10種蛋白質(zhì)來(lái)免疫動(dòng)物，但更復(fù)雜的混合物也有被使用（例如：病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、完整的小鼠脾細(xì)胞或癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取物）[3]。

? ? ? ?為了增加特定表位成功獲得納米抗體的可能性，建議對(duì)一個(gè)以上的動(dòng)物進(jìn)行免疫。它們是近系繁殖的動(dòng)物，每一個(gè)動(dòng)物都會(huì)產(chǎn)生獨(dú)特的免疫反應(yīng)，獲得更大的納米抗體 panel，從中選擇表現(xiàn)最好的納米抗體。

? ? ? ?一些研究顯示，與美洲駝和羊駝相比，駱駝或單峰駱駝中HCAb抗體比經(jīng)典抗體的比例更高。免疫接種后，取50-100毫升抗凝血（通常來(lái)自頸靜脈，盡管淋巴結(jié)活檢也是一種很好的原料），制備淋巴細(xì)胞和提取mRNA。將mRNA轉(zhuǎn)化為cDNA，用于擴(kuò)增VHH基因（兩步巢式PCR）。

? ? ? ?一些分子，如RNA或DNA，沒(méi)有免疫原性，不能刺激產(chǎn)生HCAb，或者有些化合物毒性太大、傳染性太強(qiáng)或?qū)?dòng)物或環(huán)境有害，在這種情況下，可以設(shè)想構(gòu)建一個(gè)天然納米抗體庫(kù)或一個(gè)合成的納米抗體庫(kù)。

? ? ? ? 為了能夠篩選到高親和力的納米抗體，天然抗體庫(kù)的大小一般達(dá)到109-1010，其中80%左右應(yīng)該編碼納米抗體。為了構(gòu)建這樣一個(gè)大而多樣的天然納米抗體庫(kù)，需要從多個(gè)動(dòng)物收集血液(至少10只動(dòng)物，以避免由于過(guò)敏或以前感染導(dǎo)致的HCAbs產(chǎn)生偏差)。預(yù)計(jì)每mL血液有106個(gè)淋巴細(xì)胞，而只有一小部分是B細(xì)胞，并且約50%可能表達(dá)HCAb，所以需要10L血液來(lái)構(gòu)建1010個(gè)不同VHH克隆的納米抗體庫(kù)。

? ? ? 卡梅德生物（KMD Bioscience）(https://www.kmdbioscience.cn/)建立了一個(gè)完善的、成熟的噬菌體抗體展示技術(shù)平臺(tái)。基于噬菌體展示技術(shù)平臺(tái)，卡梅德生物可以提供包括抗原設(shè)計(jì)、羊駝免疫、文庫(kù)構(gòu)建與篩選、活性功能驗(yàn)證等主要實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，并為全球的科學(xué)家提供高特異性和高親和力的羊駝VHH抗體。此外，卡梅德生物擁有豐富的抗體工程構(gòu)造經(jīng)驗(yàn)，能夠進(jìn)行立體化的抗體上下游服務(wù)，包括抗體人源化服務(wù)、人源scFV抗體庫(kù)構(gòu)建服務(wù)、人源Fab抗體文庫(kù)構(gòu)建服務(wù)、人源抗體噬菌體文庫(kù)制備服務(wù)以及磷酸化抗體定制服務(wù)、抗體親和力成熟服務(wù)等，滿足不同客戶的科研要求。

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參考文獻(xiàn)：

1. Muyldermans S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annu Rev Biochem. 2013;82:775-97.
2. De Genst E, Saerens D, Muyldermans S, Conrath K. Antibody repertoire development in camelids. Dev Comp Immunol. 2006;30(1-2):187-98.
3. Rossotti MA, Trempe F, van Faassen H, Hussack G, Arbabi-Ghahroudi M. Isolation and Characterization of Single-Domain Antibodies from Immune Phage Display Libraries. Methods Mol Biol. 2023;2702:107-147.