Molecular cloning and characterization of three phenylalanine ammonia-lyase genes from Schisandra chinensis

五味子中三種苯丙氨酸解氨酶基因的分子克隆及特性分析

摘要

苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化L-苯丙氨酸向反式肉桂酸的轉(zhuǎn)化，是植物和微生物中苯丙烷類(lèi)生物合成途徑中一個(gè)重要的關(guān)鍵酶，也是初級(jí)代謝與次級(jí)代謝之間的連接步驟。五味子（Schisandra chinensis）是一種屬于木蘭科的木質(zhì)藤本植物，其二苯并環(huán)辛烷木脂素含量豐富，并表現(xiàn)出顯著的活性。然而，相較于PAL在木質(zhì)素和黃酮類(lèi)物質(zhì)合成中的功能，PAL在木脂素合成中的功能研究相對(duì)有限。因此，克隆和鑒定該珍貴藥用植物的PAL基因具有重要意義。在本研究中，我們對(duì)五味子中的三種PAL基因（ScPAL1?3）進(jìn)行了分子克隆和特性分析。通過(guò)RACE PCR技術(shù)克隆了ScPALs基因，并對(duì)三種ScPALs基因的序列進(jìn)行了基本特征分析，隨后進(jìn)行了分子對(duì)接分析。為了確定其催化活性，通過(guò)在大腸桿菌（BL21-DE3）中使用pCold-TF載體進(jìn)行異源表達(dá)獲得重組蛋白，并通過(guò)Ni親和純化技術(shù)進(jìn)行純化。使用反相高效液相色譜（RP-HPLC）與標(biāo)準(zhǔn)化合物對(duì)比驗(yàn)證了純化后的重組蛋白的催化產(chǎn)物。此外，還確定了最適反應(yīng)溫度、pH值及不同金屬離子的影響，并在最優(yōu)條件下測(cè)定了Vmax、Kcat和Km值。還測(cè)定了三種ScPALs在不同組織中的表達(dá)情況。本研究為ScPALs的功能提供了重要的信息。

引言

五味子（Schisandra chinensis (Turcz.) Baill）是一種屬于木蘭科五味子屬的藥用藤本植物，主要分布在中國(guó)東北地區(qū)。五味子的干燥成熟果實(shí)被稱(chēng)為五味子，因其具有酸、苦、甜、辛、咸五種味道而得名。五味子一般通過(guò)大規(guī)模人工栽培生產(chǎn)，其中遼寧省是最重要的主產(chǎn)區(qū)。五味子最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，并被用于治療慢性咳嗽、遺精、遺尿、慢性腹瀉、自汗、盜汗、糖尿病、心悸和失眠等疾病【1】。根據(jù)現(xiàn)代化學(xué)和藥理學(xué)研究，二苯并環(huán)辛烷木脂素是五味子中主要的有效成分，具有保肝【2】、抗抑郁【3】、抗癌【4】、抗炎【5】、抗?jié)儭?】、抗氧化和解毒【7】等多種活性。由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理作用，二苯并環(huán)辛烷木脂素被證明為一種強(qiáng)效的保肝劑，尤其是從其衍生物中篩選出的雙環(huán)醇，已開(kāi)發(fā)為保肝藥物【2】。

二苯并環(huán)辛烷木脂素是苯丙烷類(lèi)化合物的一員，通過(guò)苯丙烷途徑合成【8】。在該途徑中，L-苯丙氨酸首先被苯丙氨酸解氨酶（PAL）脫氨生成反式肉桂酸，隨后通過(guò)CYP73A（C4H）羥化生成對(duì)香豆酸（如圖1所示）。接著，對(duì)香豆酸通過(guò)對(duì)香豆酸-CoA連接酶（4CL）生成對(duì)香豆酰-CoA，并被C3H和CCoAOMT羥化為阿魏酰-CoA。生成的阿魏酰-CoA通過(guò)肉桂酰-CoA還原酶（CCR）和肉桂醇脫氫酶（CAD）轉(zhuǎn)化為松柏醇【9】。經(jīng)過(guò)一系列催化，最終合成二苯并環(huán)辛烷木脂素（如圖1所示）。已有報(bào)道表明，在許多植物和微生物中，PAL是苯丙烷類(lèi)化合物合成中的關(guān)鍵且限速酶【10】。自Koukol和Conn于1961年在大麥中發(fā)現(xiàn)第一個(gè)PAL基因以來(lái)【11】，越來(lái)越多的PAL基因在高等植物中被研究，如鼠尾草【12】、咖啡【13】、羅勒【14】和胡黃連【15】，甚至在一些苔蘚植物【16】和真菌【17】中也有發(fā)現(xiàn)。在許多植物中，PAL蛋白通常由多基因家族編碼【10】。例如，鼠尾草中發(fā)現(xiàn)了三種PAL基因【18】，在黑楊【8】和水稻【19】中分別發(fā)現(xiàn)了六種PAL基因，而在西瓜中發(fā)現(xiàn)了12種PAL基因【20】。

從L-苯丙氨酸酶促生產(chǎn)反式肉桂酸及其在木脂素生物合成中的作用

鑒于其在苯丙素類(lèi)生物合成途徑中的重要性，苯丙氨酸解氨酶（PAL）引起了越來(lái)越多的關(guān)注。在本研究中，采用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）PCR方法，克隆了來(lái)自五味子（S. chinensis）的三個(gè)PAL基因的全長(zhǎng)cDNA序列。對(duì)推導(dǎo)出的氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，包括同源性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、氨基酸序列、結(jié)構(gòu)以及物理化學(xué)性質(zhì)。通過(guò)分子對(duì)接，分析了五味子中三個(gè)PAL基因與L-苯丙氨酸的活性位點(diǎn)，并確定了優(yōu)化的催化條件和催化動(dòng)力學(xué)。同時(shí)，通過(guò)RT-qPCR評(píng)估了三個(gè)ScPAL基因在九種組織中的特異性表達(dá)。

結(jié)果與討論

ScPAL基因的克隆與多重比對(duì)

五味子的三個(gè)PAL全長(zhǎng)基因被命名為ScPAL1-3。多重序列比對(duì)結(jié)果表明，推導(dǎo)出的ScPAL1-3蛋白與其他物種的PAL蛋白最大同源性為74.8%，如擬南芥（NP181241.1）、博落回（OVA08384.1）、蓮花（XP010261982.1）、罌粟（XP026414499.1）和五椏果樹(shù)（KAF8393567.1）（圖2）。此外，在紅色矩形框中展示了三個(gè)ScPAL蛋白中一個(gè)保守的“GTITASGDLVPLSYIAG”基序（Ala-Ser-Gly）。已知Ala-Ser-Gly（ASG）基序在活性位點(diǎn)殘基中有助于底物結(jié)合并催化MIO（3,5-二氫-5-亞甲基-4H-咪唑-4-酮）自催化結(jié)構(gòu)域的形成【21】。另一個(gè)保守殘基“FL”也在黃色矩形框中展示，該殘基對(duì)PAL酶的底物特異性至關(guān)重要【22, 23】。在PAL蛋白中，ASG和FL殘基對(duì)于以L-苯丙氨酸為唯一底物的消耗起著重要作用。因此，多重序列比對(duì)和保守殘基分析表明，所有三個(gè)ScPAL可能具有催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸的活性。

推導(dǎo)的ScPAL1-3氨基酸序列與其他PAL蛋白的多重比對(duì)。參與比對(duì)的序列如下：擬南芥（NP181241.1）、博落回（OVA08384.1）、蓮花（XP010261982.1）、罌粟（XP026414499.1）、五椏果樹(shù)（KAF8393567.1）。

蛋白質(zhì)功能域和理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)

在推導(dǎo)的ScPALs氨基酸序列的生物信息學(xué)分析中，發(fā)現(xiàn)這三個(gè)ScPAL蛋白與已知功能的PAL蛋白具有高度的序列和結(jié)構(gòu)保守性。InterProscan分析顯示，三個(gè)ScPAL蛋白結(jié)構(gòu)包含三個(gè)功能域，分別是延胡索酸酶/組氨酸酶（IPR024083）、L-天冬氨酸酶樣（IPR008948）和苯丙氨酸解氨酶（IPR023144）。此外，分析表明這三個(gè)ScPAL蛋白具有將L-苯丙氨酸催化生成反式肉桂酸的活性。我們還在ExPASy網(wǎng)站上分析了這三種蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示ScPAL1、ScPAL2和ScPAL3的分子量分別為77.26、84.15和78.61 kDa。這些蛋白的理論等電點(diǎn)（pI）在6.07到6.29之間，穩(wěn)定性指數(shù)（II）在35.76到40.78之間，預(yù)計(jì)半衰期為30小時(shí)，表明推導(dǎo)的ScPALs是穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。此外，平均親水性值在?0.113到?0.217之間，表明ScPAL蛋白沒(méi)有形成跨膜結(jié)構(gòu)（表S1）。

推導(dǎo)的ScPAL蛋白的三維結(jié)構(gòu)分析

為了明確推導(dǎo)的ScPAL蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，使用SWISS-MODEL在ExPASy上進(jìn)行了ScPAL的三維模型比較分析。芹菜（Petroselinum crispum）PAL蛋白（PDB號(hào)：1w27）的三維結(jié)構(gòu)被用作模板，并通過(guò)SWISS-MODEL（SWISS-MODEL）進(jìn)行同源建模。通過(guò)PDB sum在線工具發(fā)現(xiàn)，推導(dǎo)的ScPAL1蛋白由α螺旋（54.69%）、β螺旋（6.57%）、γ轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則線圈（31.19%）以及延展鏈（7.55%）組成。ScPAL2蛋白由α螺旋（53.65%）、β螺旋（5.93%）、γ轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則線圈（31.40%）以及延展鏈（9.02%）組成。ScPAL3蛋白由α螺旋（57.36%）、β螺旋（5.83%）、γ轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則線圈（30.00%）以及延展鏈（6.81%）組成。根據(jù)之前關(guān)于芹菜PAL蛋白的報(bào)道【24】，PAL蛋白的結(jié)構(gòu)被假設(shè)為“海馬”形狀，由前體結(jié)合域（4-亞甲基咪唑-5酮；MIO）、核心域和插入屏蔽域組成。對(duì)接結(jié)果表明，推導(dǎo)的ScPAL1蛋白中有三個(gè)氨基酸殘基（Gly-114、Asn-261和Asn-385）通過(guò)氫鍵連接；ScPAL2蛋白中有四個(gè)氨基酸殘基（Asn-264、Tyr-355、Arg-358和Asn-388）通過(guò)氫鍵連接；ScPAL3蛋白中有四個(gè)氨基酸殘基（Asn-264、Tyr-355、Arg-358和Asn-388）通過(guò)氫鍵連接在L-苯丙氨酸周?chē)?#xff08;圖3）。這些對(duì)接結(jié)果與模型蛋白與L-苯丙氨酸相互作用的殘基相似【24】?？傮w而言，這些結(jié)果表明推導(dǎo)的ScPAL蛋白具有與其他植物物種PAL蛋白類(lèi)似的功能。

ScPAL1?3與L-苯丙氨酸的分子建模（A1, ScPAL1；A2, ScPAL2；A3, ScPAL3）

ScPAL蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

為了探討ScPALs與其他PAL蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系，使用了其他植物的PAL氨基酸序列，并通過(guò)MEGA 7.0程序中的鄰接法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4）。在這棵系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，大多數(shù)植物的PAL蛋白被分為四個(gè)分支，分別是雙子葉植物、單子葉植物、裸子植物和苔蘚植物。所有三個(gè)ScPAL蛋白聚集在雙子葉植物組中。ScPAL1和ScPAL3聚集在一個(gè)節(jié)點(diǎn)中。在這一亞組中，ScPAL1和ScPAL3與已知功能性PAL基因的黃瓜（Cucumis sativus）的CsPAL具有更近的進(jìn)化關(guān)系【25】。然而，ScPAL2與其他兩個(gè)ScPAL蛋白的差異較大。

通過(guò)MEGA 7軟件對(duì)S. chinensis和其他植物物種的PAL進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。系統(tǒng)樹(shù)使用ClustalW比對(duì)結(jié)果，通過(guò)鄰接法（neighbor-joining method）和p距離構(gòu)建。每個(gè)內(nèi)部分支上的數(shù)字表示百分比引導(dǎo)值（1000次重復(fù)）。

在大腸桿菌中的異源表達(dá)及重組ScPAL蛋白的活性

多重序列比對(duì)和三維模型分析表明，ScPALs具有與其他植物功能性PAL蛋白高度的序列一致性和結(jié)構(gòu)相似性。為了探索它們的功能活性，將ScPAL基因構(gòu)建入pColdTF載體中，并在大腸桿菌BL21 (DE3)中異源表達(dá)重組蛋白，在16°C、1 mmol·L?1 IPTG的條件下培養(yǎng)24小時(shí)，通過(guò)Ni親和層析進(jìn)行純化。為了增加重組蛋白的溶解性，在ScPAL的N端融合了TF標(biāo)簽。根據(jù)SDS-PAGE分析總粗蛋白，重組ScPAL主要存在于上清液中，分子量（包括48 kDa標(biāo)簽）約為125 kDa（圖5A），與理論值一致。在酶活性檢測(cè)中，ScPALs在保留時(shí)間約為24.5分鐘處檢測(cè)到反式肉桂酸的特征峰，該峰在對(duì)照組中未被監(jiān)測(cè)到（圖5B）。這些結(jié)果表明，重組ScPALs是功能性酶，能夠?qū)-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸。

ScPAL蛋白的異源表達(dá)及酶性質(zhì) (A) 三種粗酶和純化酶的SDS-PAGE分析。M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；A1?A3分別對(duì)應(yīng)三種粗酶；CON為空載體；a1?a3分別對(duì)應(yīng)三種純化酶，表示為ScPAL1?3。 (B) 三種ScPAL的酶促反應(yīng)HPLC色譜圖。

酶性質(zhì)及動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定

研究了pH值對(duì)ScPAL活性（底物為L(zhǎng)-苯丙氨酸）的影響，pH范圍為3.0至11.0。如圖6所示，A1?A3顯示，當(dāng)pH值從3.0升高到8.0時(shí)，ScPALs的特異性活性顯著增加，而當(dāng)pH值從9.0到11.0時(shí)，活性逐漸下降。所有三種ScPAL在堿性條件下（pH 7?11）的催化活性高于酸性條件下（pH 3?6）。當(dāng)pH值從6增加到8時(shí)，三種ScPAL的催化能力急劇增強(qiáng)；當(dāng)pH值進(jìn)一步增加時(shí)，催化能力下降。ScPALs的最適pH范圍為7.5?8.0，與近期報(bào)道的Pseudozyma antarctica的兩種PAL的最適pH相同【26】。 同時(shí)，研究了金屬離子對(duì)ScPALs解氨酶活性的影響。如圖6所示，B1?B3顯示，Cu2?、Ag2?和Fe2?對(duì)ScPALs的催化活性具有強(qiáng)抑制作用，而Mn2?和Mg2?表現(xiàn)出促進(jìn)作用。這些結(jié)果表明，ScPALs的活性受到某些金屬離子的影響。 通過(guò)使用純化的重組ScPALs，評(píng)估了溫度（15?65°C）對(duì)催化反應(yīng)的影響（圖6C1?C3）。ScPALs的最適催化溫度分別為45°C、45°C和50°C。

ScPALs的酶性質(zhì) (A) pH值對(duì)重組ScPAL1 (A1)、ScPAL2 (A2)和ScPAL3 (A3)活性的影響。 (B) 金屬離子對(duì)重組ScPAL1 (B1)、ScPAL2 (B2)和ScPAL3 (B3)活性的影響。 (C) 溫度對(duì)重組ScPAL1 (C1)、ScPAL2 (C2)和ScPAL3 (C3)活性的影響。數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示（n = 3）。

為了進(jìn)一步了解ScPALs的催化能力，表1列出了不同植物中已報(bào)道的PALs的催化參數(shù)。使用L-苯丙氨酸作為底物，研究了ScPAL催化氨消除的動(dòng)力學(xué)特性（圖7A1?7A3）。L-苯丙氨酸與ScPAL1（0.17 mmol·L?1）、ScPAL2（0.25 mmol·L?1）和ScPAL3（0.21 mmol·L?1）的Km值與麻黃（Ephedra sinica）中EsPAL1（0.15 mmol·L?1）【27】和肉蓯蓉（Cistanche deserticola）中CdPAL1（0.10 mmol·L?1）【28】的Km值相似，高于芹菜（P. crispum）中PsPAL1（0.017 mmol·L?1）【29】和擬南芥（A. thaliana）中AtPAL1（0.068 mmol·L?1）【30】，但低于紅豆杉（Taxus chinensis）中TcPAL（1.10 mmol·L?1）【31】和剛竹（Bambusa oldhamii）中BoPAL4（2.07 mmol·L?1）【32】的Km值。

Table 1. The catalytic parameters of PALs in different plants

Plant	Gene name	*K*m/(μmol·L?1)	*V*max/(μmol·mg?1·min?1)	*K*cat/(s?1)	*K*cat/*K*m (s?1·mmol·L?1)	Optimal pH	Optimal *T*	Ref.
Schisandra chinensis	ScPAL1	174.1	0.66	0.85	4.87	8	45	This study
ScPAL2	253.8	0.52	0.67	2.65	7.5	45
ScPAL3	212.6	0.77	0.99	4.65	8	50
Arabidopsis thaliana	AtPAL1	68		1.80	26.47	8.4?9.2	46?48	[30]
AtPAL2	64		3.20	50.00	8.4?8.9	48
AtPAL3	2560		0.10	0.04	8.7?8.9	31
AtPAL4	71		3.00	42.25	8.4?8.8	46?48
Nicotiana tabacum	NtPAL1	59.8		1.09	18.23			[33]
NtPAL2	39.5		1.14	28.86
NtPAL3	36.4		0.78	21.43
NtPAL4	52.4		1.53	29.20
Petroselinum crispum	PsPAL1	17.2						[29]
PsPAL2	16.9
PsPAL3	24.5
PsPAL4	15
Taxus chinensis	TcPAL	1100				7.5–8.0		[31]
Bambusa oldhamii	BoPAL1	230		16.29	70.83			[32]
BoPAL2	993		21.30	21.45
BoPAL4	2072		16.32	7.88
Lycoris radiata	LrPAL3	510				8.5?9.5	35?40	[34]
Cistanche deserticola	CdPAL1	101.3		3.36	33.17	8.5	55	[28]
Ephedra sinica	EsPAL1	152		0.59	3.87			[27]
EsPAL2	144		0.46	3.17
EsPAL3	112		0.36	3.23
EsPAL4	180		0.52	2.87

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ScPAL1 (A1)、ScPAL2 (A2) 和 ScPAL3 (A3) 的酶動(dòng)力學(xué) 根據(jù)米氏方程（Michaelis-Menten equation）計(jì)算。數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，誤差條表示三次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

ScPALs的組織特異性表達(dá)分析

為了檢測(cè)ScPALs在不同組織中的表達(dá)情況，使用RACE PCR克隆了GAPDH基因作為內(nèi)參基因，并使用基因特異性引物進(jìn)行qRT-PCR分析（表S2）。在五味子的九種不同組織中，包括葉片、葉柄、莖木質(zhì)部、莖韌皮部、根木質(zhì)部、根韌皮部、果皮、果柄和種子，進(jìn)行了定量PCR分析（圖8）。結(jié)果表明，ScPAL基因在不同組織中的表達(dá)明顯不同，每個(gè)基因具有其特定的組織表達(dá)模式。其中，所有三個(gè)PAL基因在莖木質(zhì)部中的表達(dá)量最高，而在果皮中的表達(dá)量最低。眾所周知，PAL是苯丙素類(lèi)生物合成途徑中的第一個(gè)酶，也是合成木質(zhì)素的第一個(gè)酶，PAL在富含木質(zhì)素的組織中表達(dá)最高。ScPAL基因在葉片和葉柄中的表達(dá)也較高。在三種ScPAL基因中，ScPAL1在九種組織中的表達(dá)量相對(duì)較低，ScPAL2和ScPAL3的表達(dá)量分別是ScPAL1的2.5倍和2.3倍。

ScPAL1 (A1)、ScPAL2 (A2) 和 ScPAL3 (A3) 在不同組織中的相對(duì)表達(dá)水平 通過(guò)qRT-PCR確定。數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（n = 3）表示。

結(jié)論

在本研究中，我們對(duì)來(lái)自五味子（S. chinensis）的三個(gè)全長(zhǎng)PAL基因進(jìn)行了分子克隆及其特征分析。通過(guò)多重序列比對(duì)、三維建模和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，結(jié)果表明ScPAL1?3可能具有PAL活性。ScPAL1?3的重組蛋白在大腸桿菌中進(jìn)行了異源表達(dá)并純化，RP-HPLC鑒定了催化產(chǎn)物，同時(shí)研究了溫度、pH值和金屬離子的影響。最后，確定了ScPAL1?3在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，ScPAL1?3能夠催化L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸。重組ScPAL的最適溫度為45?50°C，最適pH值為7.5?8.0。Cu2?、Ag2?和Fe2?顯著抑制了ScPAL的活性，而Mg2?則提高了ScPAL的活性。L-苯丙氨酸與ScPAL1的Km值（0.17 mmol·L?1）小于ScPAL2（0.25 mmol·L?1）和ScPAL3（0.21 mmol·L?1）。ScPAL基因在莖木質(zhì)部中的表達(dá)量最高，在果皮中的表達(dá)量最低。

五味子（SCF）是一種著名的傳統(tǒng)中藥材，具有顯著的藥理活性和廣闊的應(yīng)用前景。然而，目前的研究主要集中在化學(xué)成分和藥理活性上，關(guān)于其生物合成的報(bào)道較少。對(duì)五味子中PAL的研究不僅有助于進(jìn)一步理解其生物合成途徑，還將為未來(lái)該珍貴藥用植物的藥物和生物技術(shù)應(yīng)用提供基石。

材料與方法

植物材料

植物樣本采自遼寧省鳳城縣，由沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院的賈敬明教授鑒定為五味子（Schisandra chinensis）。植物標(biāo)本保存在沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，標(biāo)本號(hào)為P-20200921。采集的植物材料被分為不同的組織組，包括葉片、葉柄、莖木質(zhì)部、莖韌皮部、根木質(zhì)部、根韌皮部、果柄、果皮和種子，立即冷凍于液氮中，并儲(chǔ)存在?80°C直至使用。

ScPALs和GAPDH的cDNA克隆

根據(jù)廠家說(shuō)明，使用Fruit-mate（Takara, 大連, 中國(guó)）和RNAiso Plus（Takara, 大連, 中國(guó)）從冷凍組織中提取總RNA。第一鏈cDNA合成使用PrimeScriptRT Master Mix（Takara, 大連, 中國(guó)）進(jìn)行。ScPAL基因的全長(zhǎng)cDNA序列通過(guò)SMARTer? RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒和RACE-PCR方法擴(kuò)增。然后，5′和3′基因特異性引物（表S2）在來(lái)自Gynura bicolor（AB550238.1）、Picrorhiza kurrooa（JQ996410.1）、Sparganium stoloniferum（KF633470.1）和Hevea brasiliensis（KX263324.1）等植物的PAL基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)。PCR產(chǎn)物被亞克隆至pbm16a載體，并轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌菌株中，通過(guò)菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，使用FastPure Plasmid Mini Kit（Vazyme, 南京, 中國(guó)）提取質(zhì)粒DNA，隨后進(jìn)行測(cè)序（GENEWIZ, 天津, 中國(guó)）?；谛滦蛄性O(shè)計(jì)基因特異性引物，擴(kuò)增ScPAL基因的全長(zhǎng)序列，隨后構(gòu)建T載體，進(jìn)行轉(zhuǎn)化和序列驗(yàn)證。所有引物均使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，并將ScPAL1（OK357444）、ScPAL2（OK357443）和ScPAL3（OK357445）的序列提交至GenBank。ScGAPDH基因按照上述程序克隆。其他植物的GAPDH多重序列比對(duì)見(jiàn)圖S2。引物列于表S2，基因序列提交至GenBank，登錄號(hào)為OK467969。

ScPALs的測(cè)序、系統(tǒng)發(fā)育分析及分子建模

ScPAL基因的全長(zhǎng)cDNA序列使用ORF Finder工具分析以生成ScPAL蛋白的完整編碼區(qū)。推導(dǎo)的ScPAL與從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的其他PAL序列進(jìn)行ClustalW多重序列比對(duì)。使用MEGA 7.0中的鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。通過(guò)SWISS-MODEL（SWISS-MODEL）預(yù)測(cè)ScPALs的三維結(jié)構(gòu)，并使用P. crispum的苯丙氨酸解氨酶（PDB: 1w27）作為模板進(jìn)行L-苯丙氨酸配體的建模。為了預(yù)測(cè)ScPALs與L-苯丙氨酸之間的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合能量，還使用Schrodinger 11.1程序進(jìn)行了對(duì)接分析。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)通過(guò)PDBsum程序分析。ScPALs蛋白的理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)和疏水性指數(shù)通過(guò)ProtParam、InterProscan和ProtScale等在線工具進(jìn)行分析。

ScPALs在大腸桿菌BL21 (DE3)中的異源表達(dá)與純化

ScPALs的編碼序列通過(guò)同源引物（表S2）擴(kuò)增后，使用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit（南京，Vazyme，中國(guó)）插入通過(guò)Kpn I和BamH I酶切的pCold-TF表達(dá)載體（Novagen, Madison, WI, USA）。通過(guò)測(cè)序確認(rèn)陽(yáng)性重組質(zhì)粒pCold-TF-ScPALs后，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中進(jìn)行蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)化菌在37°C的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)，加入終濃度為1 mmol·L?1的異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，表達(dá)條件為16°C培養(yǎng)24小時(shí)。通過(guò)在4°C下5000 g離心5分鐘收集細(xì)胞，重懸于PBS緩沖液（50 mmol·L?1，pH 7.4）后在冰浴中超聲裂解5分鐘。裂解后的總蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳并通過(guò)考馬斯亮藍(lán)R250染色以評(píng)估誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白。使用帶有6×His標(biāo)簽的Ni親和層析柱純化重組ScPAL蛋白。具體操作是用20倍柱體積的PBS平衡1 mL Ni柱（GE Healthcare, Pittsburgh USA），然后上樣。使用20倍柱體積的PBS清洗柱子，并用洗脫緩沖液（PBS, 500 mmol·L?1咪唑, pH 7.4）洗脫目標(biāo)蛋白。通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)純化蛋白的純度，并使用Bradford法測(cè)定純化重組蛋白的濃度（Solarbio, 北京, 中國(guó)）。

酶活性檢測(cè)

酶促活性通過(guò)修改后的方法【26】進(jìn)行測(cè)定。具體的反應(yīng)體系包含1 mL 0.01 mol·L?1 PBS（pH 7.5），100 μL粗蛋白提取物和0.02 mol·L?1 L-苯丙氨酸，且粗酶溶液在沸水浴中滅活5分鐘作為對(duì)照。反應(yīng)在30°C孵育30分鐘后，加入等體積的冰冷乙腈終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)0.45 μm孔徑的濾膜過(guò)濾。使用反相高效液相色譜（Agilent 1260儀器，配有光二極管陣列檢測(cè)器，Palo Alto, CA, USA）分析反應(yīng)產(chǎn)物。10 μL樣品通過(guò)柱層析（C18，5 μm，4.6 mm × 250 mm；Agilent, Palo Alto, CA, USA）進(jìn)行洗脫，梯度如下：溶劑A為甲醇，溶劑B為0.1%甲酸水溶液：0分鐘10% A；30分鐘90% A；30-40分鐘90% A；40-50分鐘10% A。流速為0.8 mL·min?1，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。通過(guò)與反式肉桂酸和L-苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)化合物的保留時(shí)間進(jìn)行比較，確認(rèn)反應(yīng)產(chǎn)物和底物。

ScPALs的酶性質(zhì)及動(dòng)力學(xué)常數(shù)

通過(guò)測(cè)量ScPAL在不同溫度（15?65°C）下的活性，研究了溫度對(duì)酶活性的影響。使用三種緩沖體系（50 mmol·L?1檸檬酸-檸檬酸鈉pH 3.0?6.0，50 mmol·L?1 PBS pH 6.0?8.0，50 mmol·L?1碳酸鈉-氫氧化鈉pH 9?11）確定酶活性的最適pH值。為評(píng)估金屬離子（Na?, K?, Ca2?, Mg2?, Zn2?, Al3?, Fe2?, Fe3?, Cu2?, Ag2?和Mn2?）對(duì)ScPAL活性的影響，將ScPAL溶液與這些金屬離子（1 mmol·L?1）在4°C下孵育24小時(shí)。隨后向反應(yīng)體系中加入終濃度為0.1 mmol·L?1的L-苯丙氨酸。通過(guò)使用底物L(fēng)-苯丙氨酸（0.05?0.5 mmol·L?1）在30°C孵育30分鐘，并在290 nm波長(zhǎng)下用分光光度計(jì)（Varioskan Flash, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA）檢測(cè)催化產(chǎn)物，測(cè)定動(dòng)力學(xué)常數(shù)。根據(jù)米氏方程（Michaelis-Menten equation）計(jì)算Km和Vmax。使用反式肉桂酸的系列稀釋液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，X為濃度，Y為在290 nm處的吸光度，方程為：Y = 5.7614X + 0.0323。在PBS中于30°C孵育30分鐘后，測(cè)定重組ScPALs催化反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)率。

定量實(shí)時(shí)PCR（qRT-PCR）

為了分析ScPALs在五味子不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平，使用Primer5軟件設(shè)計(jì)了每個(gè)ScPAL基因的引物。定量引物和用于本研究的內(nèi)參基因引物列于表S2中。qRT-PCR擴(kuò)增試驗(yàn)在實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（Bio-Rad, CF96）上進(jìn)行，最終20 μL的反應(yīng)體系中包含8 μL EvaGreen Master Mix（GENEWIZ, 南京, 中國(guó)）、1.5 μL稀釋的cDNA、0.25 μmol·L?1的每個(gè)引物，最后加入雙蒸水。qPCR溫度程序?yàn)?#xff1a;95°C 5分鐘，96°C 15秒，特定引物的退火溫度下20秒，72°C 20秒，循環(huán)35次。PCR完成后，使用相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平分析法分析結(jié)果。每組進(jìn)行了三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。